裝載人參皂苷Rh2外泌體的制備及其對肝癌細胞株Huh7、PLC半數抑制濃度測算

李美樂，趙梓粵，金凱，唐婷，黃俊期，王戈睿，謝裕安，，4

1 廣西醫科大學附屬腫瘤醫院實驗研究部，南寧 530021；2 廣西醫科大學第一附屬醫院消化內科；3 廣西中醫藥大學研究生院；4 廣西壯族自治區婦幼保健院

肝細胞癌（HCC）是最常見的惡性腫瘤之一，發病率和死亡率都非常高［1］。中醫藥是防治惡性腫瘤的有效手段之一，在產生抗腫瘤效應的同時，還能夠有效改善患者的臨床癥狀，減輕放化療不良反應，逆轉耐藥，提高生活質量［2］。人參皂苷Rh2（Ginsenoside Rh2，G-Rh2）是人參中重要生物活性物質之一，具有豐富的藥理作用，包括抗炎、抗腫瘤及改善心臟功能等［3］。因抗癌效果優異，G-Rh2被認為是未來癌癥治療的新方向，但由于其生物利用度低，直接應用于人體不能發揮其顯著的抗癌作用［4］。外泌體（Exos）是具有完整膜結構的細胞外囊泡，直徑30～200 nm，主要負責細胞間的物質運輸和信息傳遞［5］。隨著近年來對Exos的研究，有學者［6-7］發現Exos可作為一種天然的納米級藥物載體，且與傳統藥物遞送系統相比，Exos具有免疫原性低、遞送效率高、可跨過多種生物屏障等優點，還能改善一些藥物穩定性差、溶解度低、生物利用度不足和毒性較高的缺點。因此，Exos成為藥物遞送載體具有巨大的潛力。2022年5月—2023年10月，我們制備了裝載G-Rh2的外泌體Exos@G-Rh2，并測算其對肝癌細胞株Huh7、PLC的半數抑制濃度（IC50），現報告如下。

1 材料與方法

1.1 G-Rh2、細胞、試劑與儀器 G-Rh2購于北京索萊寶科技有限公司，分子式：C36H62O8，分子量：622.87，高效液相色譜法檢測純度HPLC≥98%。肝癌細胞株Huh7及PLC均購自中國科學院昆明細胞庫。DMEM高糖培養基購自美國GBICO公司；PBS磷酸緩沖鹽溶液、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、抗熒光衰減封片劑（含DAPI）購自北京索萊寶科技有限公司；青鏈霉素混合液、胎牛血清（FBS）購自BI生物公司。外泌體提取試劑盒及紅色熒光標記染料購自上海宇玫博公司。Calnexin抗體、CD9抗體、CD63抗體、TSG101抗體購自美國Abcam公司。CR21N高速離心機、CP80NX超速離心機及超速離心管均購自日本日立公司；納米顆粒跟蹤分析儀購自德國Particle Metrix公司；LC-20A高效液相色譜儀及高效液相色譜柱購自日本島津公司；NEPA21電轉儀及EC-002S電擊杯購自日本NEPA GENE公司；DYCZ-24DN電泳儀購自北京六一生物有限公司；倒置顯微鏡及熒光顯微鏡購自德國蔡司公司。

1.2 Huh7細胞中Exos的提取及純化 取適量胎牛血清置于超速離心管中，在4 ℃下，以100000 g/min超速離心16 h，收集上清液并用0.45 μm濾膜過濾，即得無Exos的胎牛血清，置于-80 ℃冰箱保存備用。Huh7細胞培養于含10%無Exos胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養液中，放置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中進行常規培養，待細胞狀態較好且細胞密度達80%左右時，收集細胞上清，使用外泌體提取純化試劑盒分離提取Huh7細胞培養上清液中的Exos，具體步驟如下：將細胞上清液在4 ℃下以3000 g離心10 min去除雜質，然后取上清液與試劑盒中的外泌體濃縮液（Exosome Concentration Solution，ECS）按4∶1比例混勻，放置于4 ℃冰箱過夜，次日取出在4 ℃下以10000 g離心60 min，離心結束后棄上清，用適量PBS重懸管底沉淀后轉至1.5 mL離心管中，在4 ℃下以12000 g再次離心2 min，取上清，轉入外泌體純化柱（Exosome Purification Filter，EPF），在4 ℃以3000 g離心10 min，EPF柱管底的液體即為純化后的Exos溶液；按照BCA法用BCA蛋白定量試劑盒對其蛋白進行定量后放置-80 ℃冰箱備用。

1.3 Exos@G-Rh2的制備 采用電穿孔［8］法。將適量純化的Exos與G-Rh2按質量比為2∶3輕輕混勻，取100 μL上述混合液液添加到2 mm電穿孔比色杯中，用NEPA21 Type Ⅱ進行電穿孔（穿孔脈沖兩次，100 v、5 ms；傳輸脈沖五次，20 v、50 ms），37 ℃溫育30 min以恢復外泌體膜，最后將上述混合液轉移至100 KDa超濾管中離心（4 ℃，4000g，15 min），棄掉超濾管下管中的液體，加入適量PBS至超濾管中含濾膜的內管，反復吹打內管壁及底部，重懸Exos@GRh2，獲得純化的Exos@G-Rh2，BCA法測量其蛋白濃度后放置-80℃冰箱備用。

1.4 Exos@G-Rh2形態、粒徑、載藥量觀察

1.4.1 Exos@G-Rh2、Exos形態觀察 用移液槍吸取適量Exos@G-Rh2及Exos懸液分別滴加于碳覆膜銅網上，靜置2 min，取適量2%磷鎢酸溶液滴加到銅網上，然后用濾紙瀝干，室溫負染5 min，晾干后置于透射電子顯微鏡下觀察Exos及Exos@G-Rh2形態并拍照。

1.4.2 Exos@G-Rh2、Exos粒徑測算 分別取適量Exos及Exos@G-Rh2混懸液以超純水稀釋至合適濃度后，輕輕吹打使其分散完全，0.22 um微孔濾膜過濾后，取濾液注入納米顆粒跟蹤分析儀進行分析。

1.4.3 Exos@G-Rh2載藥量的測定 采用高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）法，參照文獻［9-10］報道的方法，做適量修改。精密稱取G-Rh2對照品20 mg，用DMSO溶解，定容成濃度為20 mg/mL的儲備液。取適量G-Rh2儲備液，加入甲醇，制成0.2、0.5、2、5、20、50、200 μg/mL的G-Rh2溶液。色譜柱：采用Inertsustain C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：乙腈-水（60∶40），流速為1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長203 nm；進樣量20 μL。按照上述色譜條件進樣測定，以G-Rh2對照品溶液濃度為橫坐標（x），每個濃度對應的峰面積為縱坐標（y）繪制標準曲線。將Exos@G-Rh2溶液與適量的色譜甲醇充分混勻，超聲破膜，13000 g/min離心10 min，去除雜質，取出上清液，轉入進樣瓶中，按照標準曲線色譜條件進樣測定該溶液中G-Rh2含量，并計算Exos@G-Rh2載藥量。Exos@G-Rh2載藥量=Exos@G-Rh2中G-Rh2含量/Exos的蛋白含量×100%。

1.5 Exos@G-Rh2對Huh7細胞、PLC細胞的IC50測算

1.5.1 Huh7細胞、PLC細胞對Exos@G-Rh2的攝取情況觀察 采用PKH-26熒光染色法。按照外泌體紅色熒光標記染料（PKH-26）說明書配制染料工作液，根據Exos蛋白定量結果在Exos中加入適量的染料工作液，通過渦旋振蕩器混勻后室溫下避光孵育20 min，加入適量PBS，轉至EPF柱離心（4 ℃，3000 g，10 min）去除多余染料，再次獲取Exos即為PKH-26標記外泌體，待細胞貼壁后，將PKH-26標記的外泌體與適量完全培養基混勻，分別加入Huh7細胞、PLC細胞，孵育24 h后，4%多聚甲醛固定15 min， PBS清洗后用含DAPI的封片劑進行封片，使用熒光倒置顯微鏡觀察Huh7細胞、PLC細胞對Exos@G-Rh2的攝取情況。顯微鏡下，PKH-26標記的外泌體顯示為紅色熒光。

1.5.2 Exos@G-Rh2、游離G-Rh2對Huh7細胞、PLC細胞的IC50測算 采用CCK-8法。將Huh7和PLC細胞分別以5000個/孔的密度接種至96孔常規培養，次日待細胞貼壁后更換為含游離G-Rh2及Exos@G-Rh2的培養基（G-Rh2濃度分別為0、5、10、15、20、25、30、35和40 μg/mL），培養48 h后，將CCK-8溶液與DMEM培養基按1∶9比例混勻配制CCK-8工作液，隨后以細胞換液方式加入96孔板，每孔100 μL，在37 ℃下避光培養2 h，采用酶標儀測定各孔450 nm處的吸光度值，計算細胞存活率。細胞存活率=（實驗孔吸光度值-空白孔吸光度值）/（對照孔吸光度值-空白孔吸光度值）×100%。使用GraphPad Prism軟件計算藥物半數抑制濃度（Half maximal inhibitory concentration， IC50）。

1.6 統計學方法 采用Graph Pad Prism統計軟件。計量資料呈正態分布時以±s表示，比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Exos@G-Rh2的形態、粒徑、載藥量

2.1.1 Exos@G-Rh2、Exos形態比較 透射電鏡下Exos及Exos@G-Rh2形態見圖1，Exos及Exos@G-Rh2在電鏡下均可見經典的茶托狀結構，且有質膜包裹，形態無顯著差異。

圖1 透射電鏡下Exos及Exos@G-Rh2形態

2.1.2 Exos@G-Rh2、Exos粒徑比較 Exos@G-Rh2、Exos粒徑分別為（156.90 ± 10.23）nm、（143.47 ±8.62）nm，兩者相比，P＞0.05。

2.1.3 Exos@G-Rh2載藥量 G-Rh2標準曲線方程為：y=11963×x-12868（R2=0.9997），Exos@G-Rh2載藥量為24.25% ± 0.27%。

2.2 Exos@G-Rh2對Huh7細胞、PLC細胞的IC50測算結果

2.2.1 Huh7細胞、PLC細胞對Exos@G-Rh2的攝取情況 熒光顯微鏡下觀察到，在Huh7細胞、PLC細胞中，紅色熒光清晰可見，主要在細胞質中，說明PKH-26標記的Exos@G-Rh2可以被Huh7細胞、PLC細胞攝取。

2.2.2 Exos@G-Rh2、游離G-Rh2對Huh7細胞、PLC細胞的IC50比較 在Huh7細胞中，游離G-Rh2的IC50值為（34.96 ± 1.37）μg/mL，而Exos@G-Rh2的IC50值為（29.74 ± 2.83）μg/mL，兩者相比，P＜0.05；在PLC細胞中，游離G-Rh2的IC50值為（33.41 ± 1.47）μg/mL，而Exos@G-Rh2的IC50值為（30.08 ± 1.12）μg/mL，兩者相比，P＜0.05；以上結果均提示相同濃度下Exos@G-Rh2對Huh7細胞、PLC細胞活力的抑制效果強于游離G-Rh2。

3 討論

HCC是肝臟最常見的原發性惡性腫瘤，死亡率很高［11］。HCC常見治療方法包括化療、放療、手術、分子靶向治療等，目前手術仍是治療肝癌的主要手段。但由于HCC起病隱匿、病程發展迅速及易轉移復發等特點，導致大多數患者確診時已屬中晚期，無法手術治療，生存率大大降低，預后并不理想［12］。同時中晚期的HCC患者身體機能嚴重下降，多臟器功能衰竭，并出現轉移灶，故應選擇不良反應小的抗腫瘤藥物進行輔助治療，盡量延長患者生存期，減少死亡率，提高生活質量。中草藥除抗腫瘤作用外，還能改善患者免疫功能，逆轉腫瘤耐藥、減輕放化療不良反應，已經成為我國防治惡性腫瘤的有效手段之一。

G-Rh2是人參中的有效活性成分，具有誘導腫瘤細胞周期阻滯、逆轉耐藥及抑制腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲等作用［13］。但因其水溶性較差，難溶于水，治療效果并不理想。近年來，利用藥物載體傳遞GRh2的研究逐漸受到關注，顧倩等［14］采用離子交聯的方法制備殼聚糖納米粒子包載人參皂苷Rh2，結果表明該載藥納米粒子分布均一、性能穩定，能夠被A549細胞攝取，且較游離藥物抑制A549細胞的增殖作用增強。XIA等［15］采用薄膜分散法制備了人參皂苷Rh2-混合膠束體系（Rh2-M），并通過體內、體外實驗證明，Rh2-M不僅可以提高G-Rh2的溶解度、增加G-Rh2在腫瘤部位的濃度和滯留時間，還能增強G-Rh2對肺癌的抑制作用。盡管以聚合物膠束、納米粒、脂質體等作為載體可以解決藥物溶解度差及生物利用度低等難題，但也存在成本高、毒性高、缺乏靶向性等不足。

Exos是具有完整膜結構的細胞外囊泡，直徑為30～200 nm，不僅存在于細胞內，還廣泛分布于血液、尿液、唾液、母乳、羊水、腹水及膽汁等多種體液中［16］。作為一種新型的藥物遞送載體，Exos可以在細胞間進行物質和信息傳遞，能將其包被的治療藥物、基因等“貨物”靶向遞送給特定的細胞或組織［17］?，F有的載藥方法可分為內源性載藥和外源性載藥兩大類。內源性裝載是通過對親本細胞進行基因修飾使其產生具有目的藥物的Exos，外源性裝載需要先分離提純Exos，再將藥物載入其中，常用的方法包括使用電穿孔、擠出、超聲和凍融循環等［18］。作為一種新型的天然藥物遞送載體，Exos具有免疫原性低、遞送效率高和生物相容性好等優勢。

綜上所述，我們選用Exos作為載體遞送G-Rh2，通過電穿孔法成功制備了Exos@G-Rh2，并在體外考察了其對肝細胞癌活力的影響，結果顯示Exos負載G-Rh2前后形態結構無明顯變化，相較于游離G-Rh2，Exos@G-Rh2在體外對肝癌細胞的活力具有更強的抑制效果，提示Exos作為藥物載體遞送人參皂苷Rh2增強其抗腫瘤效果可行，這為進一步探討Exos作為藥物載體的潛在價值及G-Rh2的抗腫瘤作用奠定基礎。