TMEM206基因敲除小鼠小腦組織中差異表達基因的篩選及生物學功能分析

陸盈，孫順昌，2

1 上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院檢驗科，上海 200025；2 上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院無錫分院檢驗科

質子活化型Cl-（proton-activated Cl-， PAC）通道是新發現的一種Cl-通道，由3分子跨膜蛋白206（transmembrane protein 206， TMEM206）單體組成，可將Cl-轉運至細胞內，但其在細胞中的功能尚未完全清楚［1］。體外研究［2］顯示，PAC通道在pH值降至6.2時開始激活，PAC通道在酸性條件下被激活后，將Cl-從內質網或分泌囊泡內排出，防止內體腔過酸，病理條件下如缺血性卒中和腫瘤組織內，pH值較低，PAC通道也可被活化，可將Cl-轉運至細胞內，細胞容積增大，甚至腫脹死亡［3］。TMEM206蛋白氨基酸序列在脊椎動物中高度保守，且在人體各組織中廣泛分布，以腦組織中相對含量最高，提示其或許有類似管家基因的功能。TMEM206蛋白含2個跨膜螺旋和1個富含β折疊的胞外結構域，TMEM206蛋白的N-端和C-端位于胞內側［4］。我們的前期研究發現，ataxin-1蛋白與TMEM206蛋白存在相互作用，小腦組織浦肯野細胞中ataxin-1蛋白的編碼基因ATXN1基因突變是1型脊髓小腦型共濟失調（spinocerebellar ataxia type 1， SCA1）發病的分子基礎，我們推測TMEM206蛋白可能與SCA1的發病有關，因此有必要探討TMEM206基因的功能。2022年10月—2023年5月，我們通過CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除小鼠的TMEM206基因，篩選TMEM206基因敲除小鼠小腦組織中的差異表達基因并進行生物學功能分析，探討TMEM206基因的功能。

1 材料與方法

1.1 C57BL/6系TMEM206基因敲除純合小鼠的制備 TMEM206基因敲除鼠采用C57BL/6系小鼠制備，基因敲除鼠及其組織制備符合實驗動物福利與倫理原則和標準。基因敲除使用CRISPR/Cas9基因編輯技術，敲除TMEM206基因的外顯子2～外顯子5片段（見圖1）。敲除路徑：向單細胞期受精卵同時注射Cas9蛋白和靶向外顯子2和外顯子5的單向導RNA。單向導RNA序列如下，gRNA1：5'-CTAGCTTCT-GCTGATTACCC-3'；gRNA2：5'-CCTTAAAGATGTACCCCAAG-3'；gRNA3：5'-CAAGAAGGCTCACGGACCAC-3'；gRNA4：5'-AGTGAAGCCTGAAGCTCGGC-3'。TMEM206基因敲除小鼠委托江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司制備，TMEM206基因敲除突變通過PCR擴增和Sanger測序驗證，TMEM206基因敲除純合鼠通過TMEM206基因敲除雜合鼠配殖獲得。

圖1 TMEM206基因敲除示意圖

1.2 TMEM206基因敲除純合小鼠和同窩野生小鼠的飼養、體質量變化 挑選TMEM206基因敲除純合小鼠和同窩野生小鼠雌、雄各5只，常規飼養，在第49～52周稱取小鼠體質量，比較TMEM206基因敲除純合小鼠和同窩野生小鼠的體質量變化，結果顯示TMEM206基因敲除純合小鼠和同窩野生小鼠體質量差異無統計學意義（P均＞0.05），提示TMEM206基因敲除不影響小鼠的生長發育。

1.3 TMEM206基因敲除小鼠小腦組織RNA測序文庫的構建 分別取3只8周齡雌性TMEM206基因敲除純合小鼠和3只同窩雌性野生小鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉液麻醉，用預冷切片液心臟灌流，迅速斷頭，剪開顱骨取出全腦，再分離小腦組織。3只TMEM206基因敲除純合鼠分別取等量小腦組織混合為1管，3只野生小鼠也同樣取等量小腦組織混合為1管。每管組織分別用Invitrogen公司的TRIzol試劑提取總RNA，經測定濃度和純度后，構建測序文庫，用于轉錄組測序。

1.4 TMEM206基因敲除小鼠小腦組織中差異表達基因的篩選 小腦組織轉錄組測序委托蘇州金唯智生物科技有限公司完成。轉錄組測序數據經過濾后顯示，TMEM206基因敲除純合鼠小腦組織測序平均長度為148.25 bp，產生89495253測序reads，總堿基數為13268086226；野生C57BL/6J小鼠小腦組織測序平均長度為148.29 bp，產生82118098測序reads，總堿基數為12196692913。測序數據質量評估采用FastQC（v0.10.1）軟件分析，結果顯示TMEM206基因敲除純合鼠和野生鼠小腦測序堿基質量分數均在35以上，即堿基位置測序正確率在99.9%以上；兩個測序樣本絕大多數堿基序列的平均Phred堿基質量分數峰值均＞30，提示測序序列質量較好。基因差異分析使用Cuffdiff（v2.2.1）軟件，依據測序數據counts值，通過EBseq算法篩選差異表達基因，差異倍數＞2.0或＜0.5，同時錯誤發現率＜0.05時，視為差異表達基因。

1.5 TMEM206基因敲除小鼠小腦組織中差異表達基因的生物信息學分析 使用DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對差異表達基因進行基因屬性（gene ontology， GO）和京都基因和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

2 結果

2.1 TMEM206基因敲除小鼠小腦組織中差異表達基因的篩選結果 共篩選出474個差異表達基因，與正常小腦組織相比，TMEM206基因敲除小鼠小腦組織中上調的基因265個、下調的基因209個。其中表達量上調最高的10個基因由高到低依次為Acp2、Gzma、Tfe3、Zfp518a、Ppp1r26、Top3b、Mki67、Zranb1、Top2a、Chd9，表達量下調最高的10個基因由高到低依次為Ppp1r26、Gak、Slc15a2、Coch、Gm49325、Resf1、Mid1-ps1、Ptpre、Myo7a、Ntrk2。以上結果提示TMEM206基因敲除影響了小鼠小腦組織的基因表達譜。

2.2 TMEM206基因敲除小鼠小腦組織中差異表達基因的生物學功能分析結果 GO功能分析結果顯示，差異表達基因的表達產物定位于細胞外膜和主要組織相容性復合體Ⅰ類蛋白（major histocompatibility complex Ⅰ， MHC Ⅰ）較多，這些基因表達產物功能屬性主要歸類于結合轉錄因子、脂類分子及抗原分子等；差異表達基因參與的生物學過程眾多，如DNA損傷的細胞反應、細胞分化選擇、骨質礦化、BMP信號通路負調控、內皮細胞增殖負調控、血管收縮正調控等。KEGG通路富集分析結果顯示，差異表達基因在分子屬性上多為細胞黏附分子和腫瘤壞死因子路徑的分子，功能上主要與細胞吞噬和衰老有關，此外還與人乳頭瘤病毒、Ⅰ型人類T淋巴細胞白血病病毒、單純皰疹病毒、ⅤⅢ型人皰疹病毒及EB病毒等感染有關。

3 討論

脊髓小腦型共濟失調（spinocerebellar ataxia，SCA）是一類遺傳性共濟失調，病變主要累及小腦、腦干及脊髓［5］。目前已發現的SCA類型有30多型，其中SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7等型均由致病基因編碼區CAG（編碼谷氨酰胺）三核苷酸重復序列的重復數增加所致，因此又稱為多聚谷氨酰胺病或poly Q?。?-7］。SCA1的致病基因為ATXN1，基因表達產物為ataxin-1，但發病機制仍不清楚［8］。前期通過穩定同位素標記氨基酸免疫沉淀分析和蛋白免疫共沉淀，我們發現TMEM206與ataxin-1存在相互作用，提示TMEM206或許參與SCA1的發?。?］。因此，有必要探討TMEM206基因在小腦組織中的功能。研究［10］顯示，PAC通道失活時，可保護酸誘導的神經元死亡，活化時可增強神經元細胞的酸毒性。敲除TMEM206基因不影響小鼠的生殖和發育，且能改善酸誘導的神經元細胞死亡，降低缺血性中風時腦梗死面積，抑制缺血性中風時腦損傷程度［11］。深圳華大基因研究院研究［12］發現，TMEM206可保護低氧環境導致腦損傷。因此，PAC通道在神經元中具有重要功能。

本研究中，敲除TMEM206基因的純合小鼠均能正常生長發育，且成年鼠體質量與野生小鼠體質量無顯著性差異。這證實了TMEM206基因雖廣泛表達，但并非管家基因，敲除它不影響小鼠的生殖和發育。通過敲除野生C57BL/6J鼠的TMEM206基因，本研究發現小腦組織中265個基因表達量上調、209個基因表達量下調。GO功能分析顯示，差異表達基因在結構上主要是細胞外膜和MHC Ⅰ。TMEM206蛋白本身是一種膜蛋白，細胞膜缺乏TMEM206蛋白時，其他膜蛋白基因表達可能發生改變，以維持細胞膜的結構與功能［13］。MHC Ⅰ類基因在中樞神經系統中均有表達，通常定位于軸突和樹突表面，其在神經系統除發揮經典的免疫學功能外，還具有非免疫學功能，如調控神經系統的發育和突觸可塑性［14］。有研究［15］表明，經典MHC Ⅰ類分子的異常表達與神經退行性疾病如帕金森病、阿爾茨海默癥及肌萎縮性脊髓側索硬化癥等發病有關。SCA1是ATXN1基因突變引起的一種神經退行性疾病，ataxin-1與TMEM206蛋白存在相互作用，敲除TMEM206基因可引起MHC Ⅰ類分子表達異常，我們推測SCA1發病時，可能存在MHC Ⅰ類分子表達異常。

細胞黏附分子是一類介導細胞間或細胞與細胞外基質間相互接觸和結合的分子。細胞黏附分子參與細胞的識別、活化、信號轉導、增殖、分化，是免疫應答、炎癥、凝血、腫瘤轉移等重要生理和病理過程的分子基礎［16］。對敲除小鼠TMEM206基因后小腦組織表達量發生改變的474個基因經KEGG分析，發現差異表達基因在功能上多為細胞黏附分子和腫瘤壞死因子路徑分子，主要與細胞吞噬和衰老有關。TMEM206蛋白是一種離子通道蛋白，敲除TMEM206基因引起細胞黏附分子類的一些基因表達量發生改變，提示TMEM206蛋白功能或許與細胞識別、活化、增殖、分化及信號轉導等有關。

本研究還發現，敲除TMEM206基因會引起一些與人乳頭瘤病毒、Ⅰ型人類T淋巴細胞白血病病毒、單純皰疹病毒、ⅤⅢ型人皰疹病毒及EB病毒等感染有關的基因出現表達量改變。與病毒感染的細胞結構一般為細胞表面受體，本研究顯示敲除TMEM206基因，可導致一些細胞受體基因表達異常。

綜上所述，通過敲除C57BL/6J鼠的TMEM206基因，本研究發現小腦組織有474個基因表達量發生改變，其中265個基因上調、209個基因下調，這些差異表達基因參與維持細胞外膜結構穩定和細胞黏附，并與病毒感染相關，提示作為離子通道蛋白，TMEM206蛋白在體內可能有眾多的功能，其參與SCA1發病的機制有待進一步研究。