杜仲橡膠顆粒的冷凍法提取及其形態(tài)性質(zhì)研究

＊袁丹丹 張芬 鄭澤軒 趙懿琛 王娟英 李巖*

（1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物工程研究院 山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 貴州 550025 2.貴州大學(xué)茶學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物工程研究院 貴州 550025）

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）為杜仲科杜仲屬落葉喬木，被列為國家二類保護(hù)樹木，我國是現(xiàn)存杜仲資源的唯一保存地[1]。杜仲是我國傳統(tǒng)的藥用植物，也是世界適應(yīng)范圍最廣的膠原植物[2]。杜仲膠顆粒主要存在于含膠細(xì)胞中，含膠細(xì)胞在杜仲樹的根、莖、葉、皮、果實(shí)和種子等的維管束中均有分布，但各個部位的分布量并不一致[3]，其中，在葉片中的分布量為干重的3%～5%，在成熟果實(shí)中為10%～18%，在莖桿皮中為6%～12%，在根皮中為10%～12%，在種殼中為12%～18%[4-5]。杜仲膠顆粒的分離提取及純化條件相對較為復(fù)雜，前期有不少學(xué)者針對杜仲膠顆粒的提取方法進(jìn)行了研究，探索可適用于杜仲各器官中膠顆粒的提取工藝條件，對研究杜仲膠顆粒的功能具有重要意義[6]。本文選取了杜仲果實(shí)和葉片為實(shí)驗(yàn)材料，采用液氮研磨/離心法分離提取杜仲橡膠粒子，對橡膠粒子進(jìn)行觀察，并對翅果中橡膠粒子的分離提取與保存條件進(jìn)行初步探索，為杜仲橡膠粒子的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1.材料與方法

(1)實(shí)驗(yàn)材料

植物材料取自2021 年9 月種植于貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院實(shí)驗(yàn)農(nóng)場杜仲資源圃中杜仲植株的葉片及翅果。

(2)試劑與儀器

試劑：提取液：100 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L KF·2H2O、1% Vc、5 mmol/L MgSO4·7H2O、5 mmol/L巰基乙醇、2% PVP；漂洗液：100 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L MgSO4、10 mmol/L DTT；等滲溶液：10 mmol/L Tris-HCl、250 mmol/L 蔗糖。

儀器：分析天平、pH 計、光學(xué)顯微鏡、S3400 掃描電子顯微鏡、定角（45°）離心機(jī)。

(3)方法

①杜仲葉、翅果的采集與保存

采集健康、無病害的杜仲葉和翅果，分別平均分為2 份，一份放置于干燥避光的房間（15 ℃）保存，另一份放置4 ℃冰箱備用。

②杜仲膠絲的觀察

光學(xué)顯微鏡觀察膠絲：將杜仲果橫向撕開，慢慢將膠絲置于載玻片上，于光學(xué)顯微鏡下觀察。掃描電子顯微鏡觀察膠絲：將杜仲果橫向撕開，拉出膠絲保持緊繃的狀態(tài)，粘在導(dǎo)電膠上，將膠絲鍍金，于掃描電子顯微鏡下觀察。

③橡膠粒子的提取與純化

參照楊正偉等[6]的提取方法并略作修改。杜仲翅果100 g（或葉片100 g）放入研缽中，加入適量液氮研磨成粉末；將研碎后的粉末放入含有200 mL 緩沖液的燒杯中，于冰上攪拌為勻漿；將勻漿經(jīng)100 目篩網(wǎng)過濾，并將濾液分裝入4 ℃預(yù)冷的50 mL 離心管中，于4 ℃、6000 r/min 離心15 min；離心后，將提取液中的白色塊狀懸浮物盡可能多地轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中保留備用；將得到的白色懸浮物置于冰上30 min，然后于4 ℃、12000 r/min 離心5 min，將上層白色懸浮物轉(zhuǎn)移至其他離心管，并用漂洗液將橡膠粒子吹打至懸浮，再次離心，取上層膠顆粒，多次重復(fù)此步驟。此時得到的即為純化后的橡膠粒子。

④橡膠粒子的觀察與測量

光學(xué)顯微鏡觀察：取純化后的橡膠粒子（約0.1 g），添加到1 mL 漂洗液中，搖勻形成濁液，取一滴制片，于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。掃描電子顯微鏡觀察：提取杜仲翅果純化后的橡膠粒子（0.1 g），加入1.5 mL 掃描電鏡固定液，室溫下固定2 h，取一滴固定好的膠粒懸浮液滴在錫箔紙上，室溫下干燥過夜。經(jīng)用日立e-1010 離子濺射儀鍍金后，用S3400 掃描電子顯微鏡觀察。利用MATLAB R2016 a 軟件，錄入代碼，輸入光學(xué)顯微鏡下葉片和翅果橡膠粒子的圖片，對圖片中橡膠粒子直徑進(jìn)行測量統(tǒng)計。并計算提取的橡膠粒子的完好率：杜仲橡膠粒子提取完好率=形態(tài)完好的橡膠粒子個數(shù)/總的橡膠粒子個數(shù)。

⑤對不同儲存條件下的杜仲翅果提取橡膠粒子

對分別在15 ℃房間與4 ℃冰箱中保存14 d 的杜仲翅果采用1.3.3 方法提取橡膠粒子，于光學(xué)顯微鏡下觀察，并計算提取的橡膠粒子的完好率。

⑥采用不同研磨條件提取杜仲翅果中的橡膠粒子

采用1.3.3 方法分別獲取添加液氮研磨的橡膠粒子和不加液氮研磨所得的橡膠粒子，于光學(xué)顯微鏡下觀察，并計算提取的橡膠粒子的完好率。

⑦橡膠粒子的保存

將提純后的橡膠粒子分別保存于提取液、漂洗液、等滲溶液、去離子水中7 d，于光學(xué)顯微鏡下觀察。

2.結(jié)果與分析

(1)膠絲的觀察

利用光學(xué)顯微鏡觀察杜仲翅果的白色膠絲，可以觀察到膠絲中有細(xì)長的含膠細(xì)胞，橡膠粒子存在于含膠細(xì)胞中(圖1-a）；在掃描電鏡下觀察到膠細(xì)胞由于含有橡膠粒子而出現(xiàn)膨脹（圖1-b）。

圖1 （a）杜仲翅果膠絲的光學(xué)顯微鏡觀察；（b）為杜仲翅果膠絲的掃描電鏡觀察

(2)杜仲葉片和翅果中橡膠粒子的觀察

對杜仲葉片（圖2-a）和翅果中（圖2-b）的橡膠粒子進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察，并對翅果中橡膠粒子進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察（圖2-c），同時利用MATLAB R2016 a軟件分析統(tǒng)計橡膠粒子大小。分析發(fā)現(xiàn)葉片中的橡膠粒子數(shù)量較少，直徑跨度小，為1.5～7.0μm，大小均一，橡膠粒子容易聚集，有25.5%（270/1059）保持了原有形態(tài)特征；而翅果中橡膠粒子數(shù)目較多，直徑跨度大，為1.0～16.6μm，橡膠粒子之間較分散，有56.0%（597/1065）的橡膠粒子保持了原有形態(tài)特征，在掃描電鏡下翅果中橡膠粒子呈球形。

圖2 （a）光學(xué)顯微鏡下杜仲葉片中的橡膠粒子；（b）光學(xué)顯微鏡下杜仲翅果中的橡膠粒子；（c）掃描顯微鏡下杜仲翅果中的橡膠粒子

(3)不同研磨方法下杜仲翅果中橡膠粒子的形態(tài)觀察

分別于光學(xué)顯微鏡下觀察有無液氮存在下研磨提取得到的橡膠粒子的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)加入液氮研磨提取的橡膠粒子，有56.0%（625/1116）保持原始形態(tài)（圖3-a）。常溫研磨提取的橡膠粒子發(fā)生了比較嚴(yán)重的變形，僅2.9%（35/1200）保持原始形態(tài)（圖3-b）。

圖3 （a）加入液氮提取的翅果橡膠粒子；（b）直接研磨提取的翅果橡膠粒子

(4)不同儲存條件下杜仲翅果中橡膠粒子的形態(tài)觀察

于光學(xué)顯微鏡下觀察分別在4 ℃冰箱（圖4-a）與15 ℃房間中（圖4-b）儲存14 d 的杜仲翅果中的橡膠粒子的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)儲存于4 ℃冰箱中翅果的橡膠粒子有65.9%（990/1503）保持了原始形態(tài)，儲存于15 ℃房間中翅果的橡膠粒子僅有18.4%（111/603）保持原始形態(tài)。

圖4 （a）4 ℃冰箱保存14 d 后的翅果橡膠粒子；（b）為15 ℃室溫保存14 d 后的翅果橡膠粒子

(5)不同保存條件下的橡膠粒子的形態(tài)觀察

將保存于4 種不同溶液的橡膠粒子置于光學(xué)顯微鏡下觀察，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：保存于漂洗液的橡膠粒子基本沒有凝聚變形的情況（圖5-a）；保存于去離子水（圖5-b）和提取液（圖5-c）中的橡膠粒子有小部分發(fā)生了凝聚變形；保存于等滲溶液中的橡膠粒子發(fā)生了較嚴(yán)重的凝聚變形（圖5-d）。

圖5 （a）于漂洗液中保存7 d 后的橡膠粒子；（b）于去離子水中保存7 d 后的橡膠粒子；（c）于提取液中保存7 d后的橡膠粒子；（d）于等滲液中保存7 d 后的橡膠粒子

3.結(jié)論與討論

杜仲膠顆粒是一類積累在杜仲含膠細(xì)胞中的細(xì)胞器，廣泛存在于杜仲果實(shí)、葉片等器官中[7]。本實(shí)驗(yàn)利用MATLAB 軟件對葉片和翅果中的橡膠粒子進(jìn)行自動化測量，發(fā)現(xiàn)杜仲葉片中的橡膠粒子數(shù)目較少，直徑跨度小，而杜仲翅果中的橡膠粒子則相反，表明杜仲翅果中的膠含量更多，這與已有的研究結(jié)果一致[8-9]。將杜仲翅果與巴西橡膠樹[10]中的膠粒子進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，杜仲翅果橡膠粒子幾乎為圓球形，而巴西橡膠樹中的膠粒子還有橢圓形和梨形；巴西橡膠樹膠粒子直徑為0.2～10μm，而杜仲中翅果橡膠粒子直徑可達(dá)16.6μm。對杜仲翅果中的橡膠粒子的分離提取與保存條件研究顯示，保存在4 ℃冰箱的翅果中橡膠粒子形態(tài)更加完整，這是因?yàn)橄噍^于室溫下儲存，試驗(yàn)儲存于4 ℃冰箱中杜仲翅果失水較少，從而對橡膠粒子的損害更小。在研磨時加入液氮，可以使提取的橡膠粒子更接近天然形態(tài)，若在常溫下研磨，會使膠絲受到擠壓而變形，從而破壞橡膠粒子形態(tài)結(jié)構(gòu)。在漂洗液中保存的橡膠粒子基本沒有凝聚變形的情況，能較好地保持橡膠粒子的原始狀態(tài)。本研究的試驗(yàn)結(jié)果可為后續(xù)杜仲橡膠粒子的研究提供參考。