高氧誘導大鼠肺泡Ⅱ型細胞內質網自噬與其功能的關系

劉嘉璐,于愷華,郭 鴻,姚 瑩,鮑振星,施華清,李玉蘭,3*

(1.蘭州大學第一臨床醫學院,甘肅 蘭州730000;2.蘭州大學第二臨床醫學院,甘肅 蘭州730000;3.蘭州大學第一醫院 麻醉科,甘肅 蘭州730000)

全身麻醉或ICU(Intensive care unit)患者高氧血癥發生率高達83%[1],高氧可能對機體產生毒性作用[2]。肺泡Ⅱ型上皮細胞(alveolar epithelial type Ⅱ cell,AECⅡ)是高氧介導肺損傷的關鍵細胞[3],AECⅡ分泌的二棕櫚酰卵磷脂(DPPC),是肺表面活性物質的主要成分,對維持肺泡形態穩定具有重要作用[4]。內質網是細胞內蛋白合成、分泌的場所,也是維持細胞內環境穩態、提高細胞適應性的物質基礎[5]。內質網自噬(endoplasmic reticulum autophagy,ER-phagy)是細胞自噬的一種類型,在維持內質網穩態、緩解內質網應激、防御細菌和病毒感染的過程中發揮重要作用[6]。有研究表明細胞自噬參與了慢性阻塞性肺疾病(COPD)、特發性肺纖維化、急性肺損傷等肺部疾病的調節[7]。肺細胞的自噬不足或過度均可引起或加重肺損傷[8-10]。高氧肺損傷過程是否誘發了AECⅡ內質網自噬,內質網自噬對AECⅡ產生表面活性物質的功能有無影響,目前尚不明確。本實驗建立AECⅡ高氧模型,研究不同時長高氧條件下AECⅡ內質網自噬及其DPPC產生的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 RLE-6TN購自北京北納創聯生物技術研究院,為永生化大鼠 AECⅡ。

1.1.2主要試劑 RPMI-1640培養基、胎牛血清、鏈霉素、青霉素、0.25%胰酶、引物均購自武漢塞維爾生物科技有限公司;PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、實時熒光定量PCR(TB Green○RPremix Ex TaqTMII)購自Takara Bio寶日醫生物技術(北京)有限公司;DPPC酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購自上海源桔生物科技公司;ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62抗體及GAPDH抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.1.3細胞培養及分組 RLE-6TN細胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養基,置于37℃、5% CO2的常規培養箱中培養,待細胞覆蓋培養瓶80%～90%時,用胰酶消化并傳代,2～3 d傳代1次,取對數生長期細胞接種于培養瓶中,培養48 h不分段后采用隨機數字表法將細胞分為對照組(C組,21% O2常規培養72 h) 、高氧12、24、48、72 h組(H1、H2、H3、H4組,95% O2分別培養12、24、48、72 h)。

1.2 方法

1.2.1qRT-PCR檢測mRNA表達 收集各組細胞,采用Trizol 法提取總RNA,紫外分光光度計進行定量檢測。PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒進行反轉錄,實時熒光定量PCR(TB Green○R Premix Ex TaqTMII)試劑盒進行qRT-PCR測定。以GAPDH作為內參,擴增基因為FAM134B、SEC62、ATL3、RTN3、CCPG1。反 應 程 序:95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s 和 60 ℃ 30 s,40 個循環s。采用 2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。qRT-PCR引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.2.2Western blotting檢測CCPG1、FAM134B蛋白相對表達 利用 BSA蛋白定量試劑盒進行定量,不同樣品取等量的蛋白質(20 μg);6% SDS-Page變性膠電泳,條件為80 V,30 min后,將電壓調至120 V,繼續電泳90 min;恒流250 mA轉移至PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉1 h后,孵育使用相關一抗,4℃振搖過夜;次日5% PBST洗膜,10 min,4次;孵育對應的二抗,振搖1 h,5% PBST洗膜,10 min,3次;暗房曝光顯影,采用Image J軟件對條帶進行統計分析。

1.2.3ELISA法檢測DPPC水平 將細胞用RIPA裂解離心后取上清液,加入準備好的樣品和標準品,37℃溫育30 min;洗板5次,加入酶標試劑,37℃溫育30 min;洗板5次,加入顯色液A、B,37℃溫育30 min;加入終止液;15 min之內讀取OD值。測定DPPC濃度。

1.3 統計學分析

采用 GraphPad Prism 9.5.0軟件進行分析,符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示,多組間采取單因素方差分析(one-way ANOVA)進行比較。P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 PCR檢測ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62的mRNA表達

如圖1所示:與C組相比,H1組ATL3、SEC62的mRNA水平下降(P均<0.05),CCPG1、FAM134B、RTN3的mRNA水平顯著下降(P均<0.01);H2組ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62的mRNA水平差異無統計學意義(P均>0.05);H3、H4組ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62的mRNA水平顯著下降(P均<0.01)。與H1組相比,H2組CCPG1、FAM134B的mRNA水平顯著升高(P均<0.01);H3組RTN3的mRNA水平下降(P<0.05);H4組ATL3的mRNA水平下降(P<0.05),RTN3的mRNA水平顯著下降(P<0.01)。與H2組相比,H3組、H4組ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3的mRNA水平顯著下降(P均<0.01);H4組SEC62的mRNA水平下降(P<0.05);其余各組均無統計學差異(P均>0.05)。

圖1 高氧處理的各組細胞ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62的mRNA表達

2.2 Western blotting檢測相關蛋白的表達情況

如圖2所示:與C組相比,H1組CCPG1的蛋白水平下降(P<0.05),ATL3、FAM134B、RTN3、SEC62的蛋白水平顯著下降(P<0.01);H2組ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62的蛋白水平差異無統計學意義(P均>0.05);H3組和H4組ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62的蛋白水平顯著下降(P均<0.01)。與H1組相比,H2組ATL3、RTN3、SEC62的蛋白水平顯著增高(P<0.01);H3組ATL3、SEC62的蛋白水平顯著下降(P<0.01),RTN3的蛋白水平下降(P<0.05);H4組ATL3、RTN3、SEC62的蛋白水平顯著下降(P<0.01),CCPG1的蛋白水平下降(P<0.05),其余各組的蛋白水平差異無統計學意義(P均>0.05)。與H2組相比,H3組ATL3、RTN3、SEC62的蛋白水平顯著下降(P<0.01),CCPG1、FAM134B的蛋白水平下降(P<0.05);H4組ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62的蛋白水平顯著下降(P<0.01)。與H3組相比,H4組ATL3、RTN3、SEC62的蛋白水平顯著下降(P<0.01)。其余各組的蛋白水平差異無統計學意義(P均>0.05)。

圖2 高氧處理的各組細胞Western blotting檢測ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62蛋白表達

2.3 ELISA法檢測DPPC含量

如圖3所示:與C組相比,H1組DPPC產量下降(P<0.05);H2組DPPC產量增高(P<0.05);H3、H4組DPPC產量下降(P均<0.01)。與H1組相比,H2組DPPC產量顯著增高(P<0.01);H3組、H4組DPPC產量差異無統計學意義(P均>0.05)。與H2組相比,H3組、H4組DPPC產量顯著下降(P<0.01),其余各組比較差異無統計學意義。

圖3 高氧處理的各組細胞DPPC產量

3 討論

本研究基于大多數ICU重癥患者吸氧治療時間[11],探究不同時間高氧暴露對AECⅡ內質網自噬與肺泡表面活性物質產生功能之間的關系。結果顯示,高氧12 h后,內質網自噬受體水平下降,自噬蛋白ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62表達下降,DPPC產量也隨之下降;高氧24 h后,內質網自噬受體mRNA恢復到基礎水平,ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62蛋白表達也得到恢復,此時DPPC產量達到峰值;高氧48 h后,內質網自噬受體mRNA水平、ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62蛋白表達、DPPC產量再次下降;高氧72 h后,內質網自噬受體mRNA水平、ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62蛋白表達、DPPC產量仍保持較低水平。這些數據表明高氧12 h可抑制內質網自噬水平,并影響DPPC產生;高氧24 h后,隨著內質網自噬水平的恢復,DPPC產量升高并且達到了峰值;高氧48～72 h后,內質網自噬水平和DPPC產量再一次下降并維持在較低水平。因此,AECII內質網自噬與肺泡表面活性物質產生功能之間有密切的關系。

氧療是治療肺部疾病最常用的方法,短期內可能有益,但長期來看并非沒有風險,它會導致高氧肺損傷(HALI)[12],HALI的機制非常復雜,至今尚未完全清楚,其特征是嚴重的免疫細胞浸潤和AECⅡ的死亡。AECⅡ具有合成分泌表面活性物質、肺水轉運和免疫防御的功能,與肺損傷及其修復有著密切的關系[13]。肺泡表面活性物質是磷脂(PL)和蛋白質(SP)的混合物,可降低肺泡氣液界面的表面張力,避免液體外滲進入肺泡發生肺泡積液,保持肺中的液體平衡。它由大約70%至80%的PL組成,主要成分是DPPC,還有10%的SP-A、B、C和D(肺表面活性蛋白A、B、C、D)以及10%的中性脂質[4]。DPPC已被證明可以調節肺部炎癥反應[14],但在高氧肺損傷中的作用研究較少。本實驗中,高氧12 h后,DPPC產量開始下降,24 h DPPC產量達到峰值,說明適度的自噬能夠調節AECII細胞加強功能,產生更多的表面活性物質以保護高氧對肺泡的損傷。但高氧48 h后,DPPC產量再次下降,72 h DPPC產量仍在較低值。說明內質網自噬代償調節能力已達到極限,AECII產生DPPC的能力不再恢復。

內質網自噬的主要功能是降解多余的內質網膜以及有毒的蛋白聚集體,從而控制內質網體積,維持細胞穩態[15]。同時也是宿主細胞清除內質網中病毒或細菌的一種積極防御機制,在維持內質網穩態中發揮重要作用[16]。哺乳動物細胞中存在多種內質網自噬相關受體,包括ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62[17]。ATL3特點是具有GTP 酶(GTPase)活性,并參與內質網的形態和結構變化[17]。CCPG1為細胞周期進展基因1,通過去除部分攜帶不溶性蛋白的內質網,局部限制內質網應激,以維持內質網蛋白穩態[18]。在正常生理狀態下,FAM134B 蛋白通過調節內質網周轉參與細胞內穩態[19]。了解內質網自噬受體對于揭示內質網自噬的生理意義至關重要。而在某些環境下,如內質網應激、營養缺乏、錯誤折疊蛋白的積累或病原體攻擊時,內質網自噬水平顯著增加[17]。在本研究中,CCPG1、FAM134B在mRNA水平表達最為敏感,與高氧12 h相比,高氧24 h CCPG1、FAM134B mRNA水平顯著上調,但CCPG1、FAM134B在蛋白水平并未升高,這可能與轉錄后翻譯的時間不一致有關。

內質網自噬與多種疾病的發生發展相關,包括神經退行性病變、過敏性鼻炎、惡性腫瘤、糖尿病及傳染性疾病等[20-22]。相關研究表明,細胞自噬是一種保護機制,以防止高氧引起的內皮細胞損傷,使用自噬激動劑可以緩解過度氧化引起的變化并起到保護作用[23]。ZHANG等[24]發現高氧24 h通過JNK信號介導的Atg7上調引發自噬,導致SP-C在AECⅡ中積累,本實驗結果與其類似。在高氧環境下AECⅡ內質網自噬在12 h時開始下降,表面活性物質產生功能也隨之下降;當在高氧環境下24 h時,AECⅡ內質網自噬反應恢復到基礎水平,可能由于內質網自噬發生代償的原因DPPC的產量明顯增加;高氧48 h后,AECⅡ內質網自噬再次下降,由于內質網自噬無法持續代償,導致DPPC的產量下降。

綜上,本實驗結果表明,高氧環境12 h ACEⅡ內質網自噬水平與DPPC產量同時下降,24 h ACEⅡ內質網自噬水平代償上調恢復到基礎水平,且ACEⅡ中DPPC產量達到最高,48 h后內質網自噬水平與DPPC產量再次下降,72 h內質網自噬水平與DPPC產量仍保持較低水平。內質網自噬與ACEⅡ細胞功能密切相關,臨床高濃度氧療時間不宜超過24 h。