煙曲霉孢子誘導M1型巨噬細胞極化的機制研究

張曉威,張瀟怡,陳志玫,田玉玲

(長春市兒童醫院 檢驗科,吉林 長春130061)

侵襲性曲霉病(Invasive Pulmonary Aspergillosis,IPA)是除念珠菌病之外的第二大常見真菌感染性疾病[1-2]。雖然抗真菌藥物的使用在一定程度上改善了侵襲性曲霉病的預后,但是由于缺乏有效治療手段和新型藥物,侵襲性曲霉菌病的死亡率仍然很高。肺泡上皮細胞、肺內巨噬細胞和自然殺傷細胞(NK Cell)可以有效清除吸入肺內的煙曲霉孢子,防止肺煙曲霉病的發生[3-4]。巨噬細胞感知煙曲霉孢子刺激后會激活,并分泌TNF-α、IL-12、IFN-γ、IL-18、IL-6、IL-1β、MIP-1、MIP-1α、MIP-2、G-CSF、GM-CSF等炎性細胞因子或趨化因子,進一步招募外周的中性粒細胞、樹突狀細胞等來到感染部位參與免疫反應[5]。本研究以煙曲霉孢子體外刺激巨噬細胞模型為基礎,應用流式細胞術和特征基因檢測確定巨噬細胞極化狀態,并通過WB實驗探討煙曲霉孢子誘導M1型巨噬細胞極化的分子機制,為煙曲霉相關疾病的診斷和干預提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 主要實驗儀器與試劑

1.1.1主要實驗儀器 實驗中培養細胞所用II級生物安全柜、CO2孵箱來自于美國Thermo公司;流式細胞儀購自美國BD公司;實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。實驗用離心機、移液器、水浴鍋等小型設備為國產。

1.1.2主要試劑 CD80-PE、CD86-FITC、CD163-PE、CD206-FITC流式細胞抗體購自美國BD公司;CD14細胞分選磁珠和磁力柱購自德國美天旎公司;吉姆薩染色液購自上海歌凡生物;iNOS、Arg1、CD80-PE、CD86-FITC、CD163-PE和CD206基因引物由上海生工合成;qRT-PCR實驗試劑全部由北京全式金公司提供。

1.2 方法

1.2.1巨噬細胞極化 人體血液濃縮白細胞(2U,長春市中心血站)。應用Ficoll液(美國GE公司)梯度離心法獲取外周血單個核細胞(PBMC)。CD14+免疫磁珠法(德國美天旎公司)從PBMC中陽性分離單核細胞(Monocytes)。GM-CSF(50 ng/mL,美國R&D公司)體外培養Monocytes,誘導5 d成巨噬細胞,其中在第3天時補加一次GM-CSF。EDTA消化巨噬細胞并計數,重新鋪板進行巨噬細胞極化實驗。IFN-γ(10 ng/mL,美國R&D公司)和LPS(1 μg/mL,美國R&D公司)誘導M1型巨噬細胞;IL-4(10 ng/mL,美國R&D公司)和IL-13(10 ng/mL,美國R&D公司)誘導M2型巨噬細胞。煙曲霉活化孢子刺激巨噬細胞(5∶1),檢測巨噬細胞表型和特征基因表達。

1.2.2流式細胞實驗 收集培養后的巨噬細胞,PBS洗滌2次,加入200 μL染色Buffer重懸細胞,每孔5 μL的Fc-R阻斷劑,冰浴半小時,Buffer洗滌并重懸細胞,加入CD80、CD86或CD163、CD206抗體進行巨噬細胞極化類型染色,冰浴避光孵育15 min,Buffer洗滌并用200 μL甲醛固定,上機檢測。

1.2.3實時定量反轉錄聚合酶鏈式反應(Real-Time Quantitative Reverse Transcription,qRT- PCR)實驗 RNA小量制備試劑盒提取巨噬細胞總RNA,逆轉錄成cDNA。qRT-PCR實驗檢測iNOS、Arg1、CD80-PE、CD86-FITC、CD163-PE和CD206基因相對表達量,引物序列如表1所示。

表1 巨噬細胞相關基因引物及序列

1.2.4Western-blot 實驗 收集培養后的巨噬細胞,蛋白裂解后測定蛋白濃度進行定量,每孔加樣10 μg,轉膜后一抗孵育過夜,封閉后行二抗孵育,2 h后ECL發光底物進行成像分析。

1.3 統計學分析

數據應用Graphpad(7.0)軟件進行分析和作圖。多組間比較采用完全隨機單因素方差分析,配對資料采用配對t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義,每組實驗至少完成三次以上重復。

2 結果

2.1 煙曲霉活化孢子誘導M1巨噬細胞極化

IFN-γ和LPS可體外誘導M1型巨噬細胞,IL-4和IL-13可體外誘導M2型巨噬細胞。流式結果分析見表2,M1型巨噬細胞比M2巨噬細胞高表達CD80(P<0.05)和CD86(P<0.01)。M2型巨噬細胞比M1型巨噬細胞高表達CD163(P<0.05)和CD206(P<0.01)。M(A.F)(經煙曲霉活化孢子刺激的巨噬細胞)巨噬細胞比M2型巨噬細胞高表達CD80(P<0.01)和CD86(P<0.01),而CD163和CD206的表達沒有顯著變化(P>0.05)。

表2 巨噬細胞表面分子平均熒光強度(MFI)

M(A.F)巨噬細胞中iNOS基因與M2型巨噬細胞比較差異有統計學意義(P<0.01),與M1型巨噬細胞比較差異無統計學意義(P>0.05);Arg1基因與M2型巨噬細胞比較差異有統計學意義(P<0.05),與M1型巨噬細胞比較差異無統計學意義(P>0.05)。M(A.F)細胞中CD80(P<0.01)和CD86(P<0.01)的基因表達高于M2型巨噬細胞,而CD163(P<0.05)和CD206(P<0.05)的基因表達低于M2型巨噬細胞。見表3和圖1。

圖1 煙曲霉刺激巨噬細胞表型和基因表達分析

表3 巨噬細胞基因表達分析

2.2 煙曲霉活化孢子上調巨噬細胞CLRs的表達

煙曲霉活化孢子可以顯著上調巨噬細胞Dectin-1和Dectin-2分子的表達,與對照組相比,三個時間點的表達增加量分別為,6 h:Dectin-1(3.5±0.3 fold,P<0.05)和Dectin-2(3.2±0.4 fold,P<0.05);12 h:Dectin-1(5.5±0.4 fold,P<0.05)和Dectin-2(5.2±0.3 fold,P<0.05);24 h:Dectin-1(6.2±0.4 fold,P<0.01)和Dectin-2(6.4±0.5 fold,P<0.01)。雖然未經激活的巨噬細胞仍然有少量的Dectin-1和Dectin-2表達,但是與刺激組比較差異有統計學意義(P<0.05)。而熱滅火孢子組Dectin-1和Dectin-2分子的表達與對照組相近,與活化孢子刺激組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

qRT-PCR法檢測巨噬細胞Dectin-1和Dectin-2基因表達的變化,與對照組相比,三個時間點的基因表達增加倍數分別為,6 h:Dectin-1(5.2±0.4 fold,P<0.05)和Dectin-2(4.6±0.3 fold,P<0.05);12 h:Dectin-1(11.2±0.6 fold,P<0.01)和Dectin-2(9.2±0.7 fold,P<0.01);24 h:Dectin-1(22.2±2.5 fold,P<0.01)和Dectin-2(18.4±2.5 fold,P<0.01)。基因表達檢測結果與蛋白表達一致,見圖2。

圖2 巨噬細胞Dectin-1和Dectin-2表達情況

2.3 Syk/CARD9/STAT1介導巨噬細胞極化

研究發現,Syk蛋白的表達與Dectin-1/2的表達水平一致,都能在煙曲霉活化孢子的刺激下表達水平增加(4.2±0.3 fold,P<0.01)。Syk蛋白磷酸化激活后會導致西游蛋白聚集,其中最關鍵的是CARD9,它能夠結合BCL10和MALT1形成聚合物,繼而啟動細胞內炎癥信號通路。通過檢測CARD9的表達水平間接反應下游通路的激活情況。結果顯示,煙曲霉活化孢子的刺激巨噬細胞,CARD9的表達顯著上調(3.2±0.4 fold,P<0.01)。同時,其下游IκBα的磷酸化水平顯著增強(4.5±0.6 fold,P<0.01)。

STAT信號通路在巨噬細胞極化中發揮重要作用。煙曲霉活化孢子可以顯著上調細胞內STAT1的磷酸化(3.0±0.3 fold,P<0.01),而對STAT3的磷酸化無明顯作用(P>0.05)。煙曲霉活化孢子通過激活STAT1的磷酸化,參與了巨噬細胞M1極化(圖3)。

圖3 巨噬細胞Dectin下游蛋白表達情況

3 討論

曲霉菌目前有超過250多種,與生活密切相關。其中包含一些有益菌,可以用于生產藥品、飲料和食品添加劑;然而其中大部分霉菌可以導致食品腐爛,或作為病原體侵入人體而導致嚴重真菌感染[6]。煙曲霉菌是存在空氣中最常見的條件致病菌,可隨空氣吸入肺部,在免疫低下人群中發病并進展為侵襲性肺曲霉病(IPA)[7]。迄今為止,IPA診斷和治療方法有限,導致侵襲性肺曲霉病死亡率仍然居高不下[8]。

肺泡內巨噬細胞是肺內最重要的天然免疫細胞,行使著抗原識別、處理和呈遞功能、誘導特異性免疫反應,并被稱為天然免疫的前哨,維持著肺內免疫穩態。

肺泡內巨噬細胞起源于肺內定植的前體造血祖細胞或外周血來源的單核細胞。巨噬細胞感知煙曲霉孢子刺激后會激活,并分泌炎性細胞因子或趨化因子,進一步招募外周的中性粒細胞、樹突狀細胞等來到感染部位參與免疫反應[5]。巨噬細胞的極化方式在其發揮功能上具有重要差異。經典激活的巨噬細胞(M1型)主要參與炎癥反應,而替代途徑激活的巨噬細胞(M2型)主要參與組織修復和纖維化形成。本研究首先定義了煙曲霉活化孢子刺激巨噬細胞的極化類型,以IFN-γ/LPS誘導M1型巨噬細胞和IL-4/IL-13誘導的M2型巨噬細胞為對照。CD80、CD86分子和iNOS基因作為M1型巨噬細胞標記,CD163、CD206分子和Arg1基因作為M2型巨噬細胞標記。通過流式細胞術和PCR結果,表明煙曲霉活化孢子體外刺激M1巨噬細胞極化。

巨噬細胞的激活通過表面的模式識別受體啟動。Toll樣模式受體主要感知來自腸道的脂多糖成分,或病毒表面蛋白,可以活化巨噬細胞并分泌炎性細胞因子。而真菌主要通過甘露糖受體(CLRs)激活巨噬細胞[9]。Dectin-1和Dectin-2是Dectin家族中兩種重要的分子,配體通過結合其中之一或同時結合Dectin-1和Dectin-2而啟動下游信號。α-甘露聚糖可以特異性結合Dectin-2,啟動天然免疫反應[10-11]。本研究通過WB和qRT-PCR發現,煙曲霉活化孢子可以顯著上調巨噬細胞Dectin-1和Dectin-2分子的表達,并有隨著刺激時間的延長,表達效果更顯著。熱滅活孢子組Dectin-1和Dectin-2分子的表達與對照組相當,遠低于刺激組。

Syk蛋白是Dectin活化后細胞內重要的接頭蛋白。本研究發現,Syk蛋白的表達與Dectin-1/2的表達水平一致,都能在煙曲霉活化孢子的刺激下表達增加。Syk蛋白磷酸化激活后會導致西游蛋白聚集,其中最關鍵的是CARD9,它能夠結合BCL10和MALT1形成聚合物,繼而啟動細胞內炎癥信號通路[12]。通過檢測CARD9的表達水平間接反應下游通路的激活情況。結果顯示,煙曲霉活化孢子刺激巨噬細胞,CARD9的表達顯著上調。

既往研究表明,HCV病毒可以利用其編碼的核心抗原,通過TLR2途徑激活巨噬細胞,并通過抑制STAT1的磷酸化而抑制巨噬細胞極化[13]。由此可見,STATs信號通路可能在巨噬細胞極化過程中發揮調節作用。本研究發現,煙曲霉活化孢子可以顯著上調細胞內STAT1的磷酸化,而對STAT3的磷酸化無明顯作用。

綜上所述,本研究應用煙曲霉活化孢子刺激巨噬細胞發現,通過流式細胞術和PCR實驗證明煙曲霉活化孢子體外刺激M1巨噬細胞極化。進而對其進行細胞內通路研究,表明煙曲霉活化孢子通過Dectin/Syk/CARD9通路激活激活NF-κB信號通路;同時上調細胞內STAT1的磷酸化,進一步促進了M1巨噬細胞極化。本研究初步揭示了煙曲霉孢子體外激活巨噬細胞的分子機制,為煙曲霉相關疾病的診斷和干預提供重要參考和理論依據。