甲狀腺功能亢進及甲狀腺功能減退誘發老年骨質疏松的機制分析

劉 瑤,秦 迪,劉東明,王 巖,陳 雷,黃麗紅*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 老年病科,吉林 長春130033;2.內蒙古民族大學附屬醫院 內分泌科,內蒙古自治區 通遼028000;3.吉林大學中日聯誼醫院 科研中心,吉林 長春130033;4.白城市醫院 急診科,吉林 白城137000)

骨質疏松癥(osteoporosis,OP)作為一種以骨量低、骨組織微結構損壞進而導致骨脆性增加、易發生骨折為特征的全身性骨病,同時也是最常見與增齡相關的骨骼疾病[1-2]。隨著人口老齡化,老年骨質疏松的發病率逐年上升,對于老年人的危害不容小覷[3-4]。在發育、線性生長和成人骨骼轉換和維護中,甲狀腺激素起到了關鍵作用,甲狀腺激素失衡造成的甲狀腺功能異常則會影響到骨骼的穩態[5-6]。甲亢(甲狀腺功能亢進)狀態下,骨轉換升高,重塑時間縮短;相反甲減(甲狀腺功能減退)則會導致骨轉換降低,骨重塑周期延長,這些使得骨形成和骨吸收之間的差異導致了骨量的負平衡[7]。由此可見,無論是甲亢或甲減,均可能會出現骨密度減低,并有骨質疏松甚至骨折的風險[6]。本文采用挖掘并預測甲狀腺功能亢進及甲狀腺功能減退與老年骨質疏松之間的交集靶點基因以及相關信號通路,旨在通過生物信息學方法去分析他們之間的潛在機制并對未來治療策略提供新思路。

1 材料與方法

1.1 獲取老年骨質疏松差異表達基因

老年骨質疏松基因表達譜下載于公共基因表達數據庫(Gene Expression Omnibus,GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/),數據集為GSE35958,該數據集收錄了9例骨髓樣本,包括原發性老年骨質疏松5例和與年齡匹配的對照組4例;數據集通過應用GEO2R來分析病例組與對照組之間的差異表達基因(DEGs),從而獲得老年骨質疏松相關DEGs,運用Origin軟件繪制差異表達火山圖。

1.2 篩選老年骨質疏松-甲亢、老年骨質疏松-甲減共靶點基因

通過人類基因綜合數據庫GeneCards (https://www.genecards.org/)和人類孟德爾遺傳在線數據庫 (Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)(https://www.genecards.org/) 分別搜索“osteoporosis”,“hyperthyroidism”,“hypothyroidism”獲取骨質疏松、甲亢及甲減疾病的相關靶點基因(檢索時間為建庫至2022年12月),并將搜索得到的骨質疏松、甲亢及甲減靶點基因與2.1得到的老年骨質疏松DEGs整合并刪除重復靶點后得到交集靶點基因,并以韋恩圖的形式繪制出來。

1.3 功能富集分析

為了描述靶點基因的功能角色,將2.2獲得的交集靶點基因用R語言對其篩選,進行基因本體(gene ontology,GO)、京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析,并將前5個富集結果進行可視化。

1.4 構建PPI 網絡和篩選關鍵基因

將1.2獲得的交集靶點基因借助交互基因檢索工具(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes,STRING)(https://cn.string-db.org/),物種選擇人類(Homo spaiens),可信度設置為中等可信(medium confidence 0.400),隱藏網絡中已斷開的節點,從而分別構建老年骨質疏松與甲亢、老年骨質疏松與甲減之間的交集靶點基因的蛋白質-蛋白質間相互作用(Protein-Protein Interaction,PPI)網絡,并應用Cytoscape軟件進行可視化,并按照連接度值(Degree)篩選PPI網絡連接度前 5位的關鍵基因(hub genes)。

2 結果

2.1 老年骨質疏松差異表達基因

將老年骨質疏松數據集GSE35958中的老年骨質疏松組和對照組根據|logFC|>1、P-value<0.05 的篩選標準得出相應的DEGs,運用 Origin軟件對差異表達結果進行火山圖繪制,結果顯示老年骨質疏松DEGs共有7359個,其中低表達基因有 1429個,高表達基因有 5930 個,見圖1。

圖1 老年OP差異表達基因火山圖

2.2 老年骨質疏松-甲亢、老年骨質疏松-甲減交集靶點基因

GeneCards及 OMIM 在線數據庫(將GeneCards數據庫得到的基因進行關聯分數(relevance score) >1篩選)中搜索并篩選得出的骨質疏松、甲亢及甲減3種疾病相關靶點數量為1688、440、1094,并將其骨質疏松基因靶點和老年骨質疏松DEGs分別與甲亢、甲減靶點進行匹配映射,最終得到67和126個交集靶點基因,見圖2,圖3。

圖2 老年OP與甲亢靶點基因交集韋恩圖

圖3 老年OP與甲減靶點基因交集韋恩圖

2.3 功能富集分析

將1.2得出的交集靶點基因利用R語言軟件分別進行GO分析及KEGG分析。對于甲亢相關老年骨質疏松的靶點基因GO富集前5名結果顯示,在生物學過程中 (biological process,BP),這些基因主要富集于腺體發育、骨化作用、白細胞-細胞黏附、細胞黏附的正性調控、白細胞遷移等;在細胞組分(cellular component,CC) 方面主要富集于內質網腔、質膜的外側面、血漿脂蛋白顆粒、脂蛋白粒子、脂蛋白復合物等;在分子功能方面 (molecular function,MF),主要富集于受體配體活性、信號受體激活劑活性、蛋白酶結合、生長因子結合、脂蛋白顆粒結合等;KEGG通路富集前5結果顯示,其主要集中在Ⅰ型糖尿病、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、人類T細胞白血病病毒Ⅰ型感染、移植物抗宿主病、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性等,見圖4。

圖4 GO富集分析與KEGG通路分析氣泡圖

而對于甲減相關老年骨質疏松的靶點基因,GO富集前5名結果顯示,在生物學過程中,這些基因主要富集于腺體發育、細胞黏附的調控、組織重構、上皮細胞增殖、細胞因子產生的正向調控等;細胞組分方面,基因主要富集于質膜的外側面、內質網腔、包被囊泡、細胞頂端部分、血漿脂蛋白顆粒等;分子功能方面,這些基因主要富集于RNA聚合酶II-特異DNA結合轉錄因子結合、DNA結合轉錄因子結合、核受體結合、生長因子結合、外源蛋白結合等;KEGG通路富集前5名結果顯示,其主要富集在糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、T17細胞分化、人類T細胞白血病病毒Ⅰ型感染、癌癥中的蛋白聚糖、人巨細胞病毒感染等,見圖5。

圖5 GO富集分析與KEGG通路分析氣泡圖

2.4 PPI 網絡互作及關鍵基因

將1.2得出的交集靶點基因分別導入STRING數據庫,得到蛋白互作網絡圖,應用Cytoscape軟件,分別得出Degree排名前5的hub genes。甲亢相關老年骨質疏松的關鍵基因有TNF(tumor necrosis factor,degree=39),AKT1(AKT1 substrate 1,degree=36),ALB(albumin,degree=36),CD4(CD4 molecule,degree=30),IL-2(interleukin 2,degree=27);甲減相關老年骨質疏松的關鍵基因有ALB(albumin,degree=62),AKT1(AKT1 substrate 1,degree=58),TP53(tumor protein p53,degree=57),TNF(tumor necrosis factor,degree=57),CTNNB1(catenin beta 1,degree=53),見圖6,圖7,表1,表2。

表1 甲亢相關老年OP前5關鍵基因

表2 甲減相關老年OP前5關鍵基因

3 討論

隨著全球人口老齡化的到來,骨質疏松癥作為退行性疾病發病率不斷上升,已成為世界范圍內備受關注的主要健康問題。甲狀腺激素作為維持骨骼結構和強度方面的一個必不可少的因素,當發生甲狀腺功能異常(如甲亢或者甲減)時,可成為導致骨病的一個危險因素,然而甲狀腺激素過多或不足在老年骨質疏松發病中的作用一直被低估,其潛在發病機制尚不清楚[7]。本文借助生信數據去探討甲亢、甲減與老年骨質疏松之間可能的關聯機制及分子治療靶點。本研究發現了可能參與甲亢誘發的老年骨質疏松67個靶點基因以及參與甲減誘發的老年骨質疏松126個靶點基因。甲亢、甲減與老年骨質疏松之間相互作用的信號通路主要涉及人類T細胞白血病病毒Ⅰ型感染、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、Ⅰ型糖尿病、移植物抗宿主病等。其中TNF、AKT1、ALB、CD4、IL2可能是治療甲亢誘發的老年骨質疏松的主要潛在靶點;ALB、AKT1、TP53、TNF、CTNNB1則可能是治療甲減誘發的老年骨質疏松的主要潛在靶點。

TNF(腫瘤壞死因子)可直接作用于破骨細胞前體,促進破骨細胞發生[8],且有報道顯示TNF抑制劑會使骨密度增加,這可能與骨吸收減少和骨生成增加相關[9-10]。對于TSH抑制骨吸收的過程當中,TNFα則是介導其中的關鍵因素[11],也有證據表明TNFα的多態性與Graves病相關[12]。AKT(也被稱為蛋白激酶B或PKB),其包括3個密切相關的亞型AKT1,AKT2和AKT3(或分別稱作PKBα、β、γ),AKT1作為其中的一個亞型,在組織中廣泛分布,并參與細胞的生長和存活[13],并且有研究發現AKT1作為成骨細胞的信號中介,可以控制成骨細胞與破骨細胞的分化[14-15]。ALB(白蛋白)是一種在人體血液中含量非常豐富的多功能血漿蛋白,其中心由疏水自由基組成,這些自由基是多種化合物的結合位點,例如甲狀腺素(Thyroxine,T4),它是關于甲狀腺激素快速交換資源的關鍵,可快速穩定T4水平[16]。有研究觀察到低白蛋白血癥持續時間越長,在同一解剖部位發生骨質疏松的風險則越高,表明了較低濃度的血清白蛋白水平與骨質疏松具有相關性,且獨立于任何其他變量,但相關機制尚不明確[17]。有文章在確定原發性骨質疏松的差異表達基因中發現TP53(腫瘤蛋白p53)和CTNNB1(β連環蛋白1)是表達上調最多的DEGs,其可能在原發性骨質疏松癥中發揮重要作用[18]。TP53作為細胞衰老的標志物之一,有實驗表明循環TSH水平的升高和T4、T3水平的降低都與其基因表達降低顯著相關[19]。CTNNB1編碼β-連環蛋白基因,在影響骨質疏松和骨折易感性的生物途徑中起著至關重要的作用[20],已有研究指出并強調CTNNB1在骨質疏松中成骨分化的作用,這可能會在骨質疏松癥新療法方面提供新的策略[21]。在最近有關骨質疏松的生物信息學實驗驗證研究文章中,分析了炎癥因子與骨質疏松關鍵基因的相關性,并進一步通過孟德爾隨機化分析細胞因子與骨質疏松的結局,最終發現IL2(白介素-2)的升高可導致骨質疏松的發生,兩者之間存在顯著的因果關系[22]。

人類T細胞白血病病毒Ⅰ型主要感染CD4+ T細胞,并在感染者中誘發慢性、持續性感染[23]。有分析發現CD4(CD4 分子)與骨吸收呈負相關,即高水平CD4與低轉化型的骨質疏松癥相關[24]。研究發現具有趨化和炎癥特征CD4+細胞毒性T淋巴細胞(CD4+ CTL)參與了Graves眼病的發病機制,這種促進炎癥的CD4+ CTL亞型可從血液遷移到眼眶組織,并根據其細胞毒性作用介導眼眶的炎癥和重塑,它的細胞毒性和趨化性水平的升高很可能會與Graves眼病復發相關[25-27]。晚期糖基化終產物(Advanced glycation end products,AGEs)及其受體(receptor for AGEs,RAGE)被認為是發生炎癥反應的重要組成部分,AGEs與多種受體相互作用,特別是RAGE,AGE-RAGE相互作用會影響到細胞的功能、代謝,以及導致多種生物學效應,其中就包括糖尿病的微血管及大血管的相關并發癥,并且也導致多種信號的激活,包括PI3K/AKT、MAPK/ERK等[28]。RAGE可在包括炎癥細胞、成骨細胞和破骨細胞在內的多種細胞上表達[29],且有研究已證實AGE-RAGE信號通路在促進成骨方面發揮著重要作用[30]。Ⅰ型糖尿病患者與胰島素缺乏、骨穩態受損有關,成骨細胞和破骨細胞都受到其影響,長期的高血糖和炎癥環境下可導致骨形成和骨吸收之間的負骨平衡,因此Ⅰ型糖尿病患者發生骨密度降低、骨折及骨折愈合不良的風險與一般人群相比會更高[31-33]。甲狀腺激素影響著糖代謝的穩態,甲狀腺疾病與糖尿病二者之間相互關聯,二者作為常見的內分泌疾病,通常并存,Ⅰ型糖尿病患者中甲狀腺疾病的發病率較高[34-36]。移植物抗宿主病(GVHD) 作為器官移植后常見并發癥,現有研究表明在造血干細胞移植后GVHD的患者就包括甲狀腺功能異常和骨質丟失[37]。

本文不足之處,結果為未經過實驗驗證所得出的生物信息學研究,需隨疾病數據庫的完善以及在動物實驗和臨床研究的基礎上進一步探討上述信號通路相關變化,從而更加全面的了解甲亢、甲減與老年骨質疏松疾病之間的機制及治療策略。

綜上所述,本文雖然通過生信分析去分別預測出甲亢、甲減與老年骨質疏松相關信號通路及關鍵基因,但是尚需體內、外實驗的驗證。在接下來的研究中,將進一步通過分子-細胞-動物水平多層次來驗證上述關聯基因及信號通路。旨在為臨床開發防治甲亢、甲低誘發的老年骨質疏松的小分子基因治療藥物奠定前期基礎。