院內(nèi)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌分子流行病學(xué)和耐藥性研究

劉麗娟,陳秀美,張 敏,翟 偉,任玉國

(濟(jì)南市人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科,山東 濟(jì)南271100)

鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii,AB)是重要的條件致病菌,屬于非發(fā)酵革蘭陰性球桿菌,較強(qiáng)的獲得性耐藥和克隆性傳播的能力,致使多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(MDRAB)在院內(nèi)各類重癥監(jiān)護(hù)病房廣泛流行[1]。雖然其毒力、致病性不強(qiáng),但其極高的檢出率和耐藥率,極易引起爆發(fā)流行。一旦由條件致病菌轉(zhuǎn)化為致病菌,給臨床抗感染治療帶來極大困擾。掌握院區(qū)內(nèi)MDRAB的耐藥機(jī)制、傳播途徑及方式對規(guī)范應(yīng)用抗菌藥物、預(yù)防控制MDRAB的院內(nèi)爆發(fā)流行極為重要。本研究運(yùn)用多位點(diǎn)序列分型(MultilocusSe-quenceTyping,MLST)和脈沖場凝膠電泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)同時(shí)對醫(yī)院臨床及環(huán)境分離的MDRAB菌株間的進(jìn)化關(guān)系及院內(nèi)主要流行克隆進(jìn)行綜合分析,為預(yù)防控制MDRAB的院內(nèi)爆發(fā)流行提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 菌株來源

收集2020年5月至2021年4月院內(nèi)臨床及環(huán)境分離出的非重復(fù)MDRAB菌株 34株。PFGE標(biāo)準(zhǔn)菌株為布倫鄧祿普沙門菌H9812(山東省CDC提供)。

1.2 細(xì)菌鑒定及藥物敏感試驗(yàn)

BD Phoenix NMIC-413復(fù)合板進(jìn)行菌種鑒定及藥物敏感性試驗(yàn),執(zhí)行2020CLSI標(biāo)準(zhǔn)。另外頭孢哌酮/舒巴坦敏感性試驗(yàn)執(zhí)行CLSI中頭孢哌酮的標(biāo)準(zhǔn),替加環(huán)素敏感性試驗(yàn)執(zhí)行FDA的標(biāo)準(zhǔn)(S≤2 mg/L,I=4 mg/L,R≥8 mg/L),多黏菌素執(zhí)行2020 USCAST的折點(diǎn)(S≤2 mg/L,R≥4 mg/L)。大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853作為質(zhì)控菌株。

1.3 耐藥基因檢測

采用煮沸法提取細(xì)菌DNA模板,多聚酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法對β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因blaKPC、blaNDM-1、blaOXA-23-like、blaOXA-24-like、blaOXA-51-like、blaOXA-58-like、blaOXA-143-like、CTX、TEM、DHA等進(jìn)行檢測,引物參照文獻(xiàn)[2-5]。對部分陽性基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序,并將測序結(jié)果在GenBank網(wǎng)上查詢。

1.4 多位點(diǎn)序列分型

選擇 Oxford方案對鮑曼不動(dòng)桿菌7個(gè)管家基因gltA、gyrB、gdhB、recA、cpn60、gpi和rpoD進(jìn)行序列擴(kuò)增并測序。將測序結(jié)果提交到網(wǎng)站(http://pubmlst．org/abaumannii)進(jìn)行在線序列比對,確定其等位基因型及ST型。再用eBURST軟件進(jìn)行菌株親緣性分析,其中7個(gè)位點(diǎn)中有6個(gè)及6個(gè)以上位點(diǎn)相同即定義為遺傳相關(guān)克隆[6-7]。

1.5 脈沖場凝膠電泳

將37℃ 24 h血平皿培養(yǎng)的MDRAB配制成濃度為3.0～3.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙骸－傊悄z包被,蛋白酶K裂解消化,ApaI限制性內(nèi)切酶于37℃酶切,1%瓊脂糖凝膠,電壓為 6.0 V/cm,電場夾角為 120°,進(jìn)行19 h電泳。EB染色后成像。用BioNumerics軟件對電泳圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。PFGE結(jié)果按照Tenovel等[8]推薦方法判讀,圖譜完全一致為同一型,1～3個(gè)條帶不同者為同一型的不同亞型,差異3個(gè)條帶以上者為另一型。PFGE 條帶相差≥7條為不同克隆。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用WHONET5.6軟件對MDRAB菌株資料進(jìn)行耐藥性分析。

2 結(jié)果

2.1 科室及標(biāo)本分布

收集2020年5月至2021年4月非重復(fù)MDRAB菌株34株,臨床標(biāo)本25株,環(huán)境標(biāo)本9株。25株臨床標(biāo)本科室分布:重癥醫(yī)學(xué)科病房13株,呼吸重癥科病房5株,神經(jīng)外科病房2株,急癥科病房2株、關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)科、脊柱外科病房、新生兒科病房各1株。9株環(huán)境MDRAB菌株均來源于重癥醫(yī)學(xué)科病房。標(biāo)本來源:病房環(huán)境采樣9株、血液8株、痰液7株、灌洗液5株、穿刺液4株、尿液1株。見表1。

表1 MDRAB科室及標(biāo)本的分布

2.2 抗菌藥物敏感試驗(yàn)MIC值

34株MDRAB對頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦、氨芐西林/舒巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、環(huán)丙沙星、慶大霉素、亞胺培南、美羅培南均100%耐藥;氨基糖苷類阿米卡星的耐藥率為55.9%(19/34)、妥布霉素的耐藥率均為82.4%(28/34);復(fù)方新諾明的耐藥率為88.2%(30/34);沒有出現(xiàn)對米諾環(huán)素和替加環(huán)素耐藥的菌株,但中介率分別為41.2%(14/34)和14.7%(5/34);對多黏菌素100%敏感。見表2。

表2 MDRAB抗菌藥物的MIC值(μg/mL)

2.3 β-內(nèi)酰胺類耐藥基因及測序結(jié)果

34株MDRAB blaOXA23、blaOXA-51及blaOXA64gp基因PCR擴(kuò)增均為陽性。TEM基因PCR擴(kuò)增陽性率為85.3%(29/34),未檢出blaOXA-24、blaOXA-58、blaOXA-143、blaKPC、blaNDM-1、CTX、DHA等β內(nèi)酰胺酶基因。blaOXA-51-Like+blaOXA-23-like+blaTEM三聯(lián)碳青霉烯耐藥模式為85.3%。隨機(jī)抽取陽性基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序,結(jié)果分別為blaOXA23、blaOXA-51、blaOXA64及TEM。部分產(chǎn)物擴(kuò)增及測序見圖1～3。

注:Marker為DNA標(biāo)志物;泳道1～34為臨床blaOXA23基因陽性菌株

注:Marker為DNA標(biāo)志物;泳道1～3,9,14為臨床blaTEM-1基因陰性菌株;泳道4～8,10～13,15～34為臨床blaTEM-1

圖3 OXA23基因PCR產(chǎn)物測序圖

2.4 MLST分子分型及PFGE同源性分析結(jié)果

25株臨床MDRAB用MLST和PFGE進(jìn)行同源性分析,結(jié)果得到7個(gè)ST序列類型:依次為ST540(10/25)、ST195(5/25)、ST369(3/25)、ST208(2/25)、ST381(2/25)、ST938(2/25)和ST451(1/25);6個(gè)克隆群:分別為A群(9/25)、D群(8/25)、C群(4/25)、F群(2/25)、E群(1/25)、G群(1/25)。ST540和ST195是主要流行的序列類型,A群、B群是主要流行的克隆群。9株環(huán)境MDRAB MLST和PFGE同源性監(jiān)測得到2個(gè)ST序列類型:ST208(8/9)、ST540(1/9);2個(gè)克隆群:B群(8/9)、C群(1/9)。見表1及圖4。

圖4 34株MDRAB PFGE聚類分析

3 討論

MDRAB是院內(nèi)感染的重要病原菌,尤其在重癥監(jiān)護(hù)病房。本研究25株臨床MDRAB菌株20株來源于重癥監(jiān)護(hù)病房,其中重癥醫(yī)學(xué)科13株、呼吸重癥病房5株,急癥科監(jiān)護(hù)病房2株。重癥醫(yī)學(xué)科及院內(nèi)各專業(yè)重癥監(jiān)護(hù)病房患者大部分伴有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病,免疫力差、住院時(shí)間長、具有多種抗菌藥物應(yīng)用史,伴有侵入性操作,原定植于呼吸道的MDRAB菌株極易隨著侵襲性操作發(fā)生位置的遷移,由定植菌轉(zhuǎn)化為致病菌。25株MDRAB菌株主要來源于呼吸道標(biāo)本(11/25)和血液標(biāo)本(8/25)。文獻(xiàn)顯示鮑曼不動(dòng)桿菌逐漸成為醫(yī)院獲得性血流感染常見病原菌,有報(bào)道在中國西部地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌已經(jīng)成為醫(yī)院獲得性血流感染第六位常見病原菌[9],這多與重癥監(jiān)護(hù)患者接受侵入性操作是相關(guān)的[10]。

CRAB最主要的耐藥機(jī)制是產(chǎn)生能夠水解碳青霉烯的OXA型的D類β-內(nèi)酰胺酶,包括6個(gè)家族:OXA-23-like、OXA-24-like、OXA-51-like、OXA-58-like、OXA-143-like和OXA-235-like。OXA-51-like酶是鮑曼不動(dòng)桿菌本身固有,其他耐藥基因均為外界獲得的。其中OXA-23型酶最常見,可同時(shí)存在于染色體和質(zhì)粒中,是與CRAB 院內(nèi)感染暴發(fā)相關(guān)最常見的耐藥基因。本研究34株MDRAB 100%攜帶blaOXA23、blaOXA-51、blaOXA64基因,TEM-1基因的攜帶率為85.3%(29/34),未檢出blaOXA-24、blaOXA-58、blaOXA-143、blaKPC、blaNDM-1、CTX、DHA等β-內(nèi)酰胺酶基因。blaOXA23為院內(nèi)MDRAB菌株攜帶的最主要的碳青霉烯酶,是導(dǎo)致耐藥性傳播的主要基因型。blaOXA-51-Like+blaOXA-23+blaTEM-like是院內(nèi)主要碳青霉烯耐藥模式,高達(dá)85.3%(29/34)。對臨床常用β-內(nèi)酰胺類及加酶抑制劑藥物均表現(xiàn)出了多重耐藥的特征,與課題組以往研究一致[11]。沒有出現(xiàn)對米諾環(huán)素和替加環(huán)素耐藥的菌株,但中介率分別為41.2%(14/34)和14.7%(5/34),對多黏菌素100%敏感。提示多黏菌素和替加環(huán)素已取代碳青霉烯類抗生素成為院內(nèi)治療鮑曼不動(dòng)桿菌的最后一道防線。但是有研究[12]提示,臨床分離的對多黏菌素敏感鮑曼不動(dòng)桿菌,異質(zhì)性耐藥率高達(dá)83%,臨床應(yīng)高度重視抗生素的規(guī)范化應(yīng)用。

MLST和PFGE是菌株同源性分析常用的方法,其中PFGE被譽(yù)為細(xì)菌分子分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”,在識別和追蹤感染暴發(fā)或流行中被廣泛應(yīng)用[13-14]。從25株臨床MDRAB MLST和PFGE同源性監(jiān)測結(jié)果來看,2020年至2021年院內(nèi)臨床流行的MDRAB序列類型為ST540(10/25)和ST195(5/25),主要的克隆群為A群(9/25)、D群(8/25);2020年和2021年院內(nèi)MDRAB流行的主要ST序列型及克隆群存在一定的差異。2020年以ST195(5/16)、D克隆群(8/16)為主,2021年以ST540(7/9)、A克隆群(5/9)為主,ST540、A克隆群貫穿2020年至2021年且在多個(gè)重癥監(jiān)護(hù)病區(qū)播散流行。與環(huán)境MDRAB的主要ST208(8/9)和克隆群B群(8/9)不一致。25號感染患者監(jiān)測到的MDRAB為ST540序列 、G1克隆群與其周圍環(huán)境MDRAB的ST208和B克隆群完全不同。環(huán)境中MDRAB檢測到的B克隆群2年內(nèi)均未在臨床MDRAB菌株內(nèi)流行過。與相關(guān)研究重癥監(jiān)護(hù)室中鮑曼不動(dòng)桿菌的感染暴發(fā)與其環(huán)境傳播密切相關(guān)[15]不一致。這可能和臨床及環(huán)境MDRAB標(biāo)本的采樣時(shí)間段及標(biāo)本量的代表性存在一定關(guān)系。需要在今后的研究中進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述,院內(nèi)MDRAB主要來源于重癥監(jiān)護(hù)病房,blaOXA-51-Like+blaOXA-23+blaTEM-like是院內(nèi)主要碳青霉烯耐藥模式。院內(nèi)臨床流行的主要序列類型為ST540和ST195,主要的克隆群為A群、D群。ST540、A克隆群MDRAB貫穿整個(gè)研究階段且在多個(gè)重癥監(jiān)護(hù)病區(qū)播散流行。臨床與環(huán)境MDRAB主要流行的ST序列型和克隆群不一致。下一步研究需要進(jìn)一步規(guī)范對臨床及環(huán)境樣本采集量、方式及時(shí)間點(diǎn),對菌株進(jìn)行同源性分析,識別和追蹤感染暴發(fā)或流行的根源,從而預(yù)防和控制MDRAB的進(jìn)一步傳播。