骨髓染色體聯合FISH技術在惡性血液病診斷中的應用價值

李付廣,張曉靜,謝小雷,湯素環,唐 江,吳愛娟,尹衛國

(1.清遠市人民醫院 分子診斷中心·廣州醫科大學附屬第六醫院,廣東 清遠511518;2.清遠市人民醫院 藥學部·廣州醫科大學附屬第六醫院,廣東 清遠511518)

細胞遺傳學和分子生物學在惡性血液病的發生、發展、診斷以及分型治療中發揮著重要作用,是對傳統的血液學檢查和骨髓涂片形態學檢查的重要補充[1]。隨著世衛組織(WHO)對造血及淋巴組織腫瘤診斷分型標準的不斷修訂完善,染色體核型在惡性血液病診斷分型中的作用日益突出,已成為細胞形態學(Morphology,M)、免疫學(Immunology,I)、細胞遺傳學(Cytogenetics,C)和分子生物學(Molecular biology,M)分型(簡稱MICM分型)重要的組成部分[2]。然而,由于骨髓染色體標本制備復雜,易受多種因素的影響,如何穩定獲得形態良好、長度適宜、分散較好以及數目較多的中期骨髓染色體分裂相仍是細胞遺傳學研究中的一個難題[3]。各實驗室應根據自身實驗條件對影響骨髓染色體制備的影響因素進行優化,以達到最佳制備效果。本研究通過對骨髓細胞接種培養、收獲、顯帶方法等可能影響骨髓染色體制備的每一個環節進行了合理改良和優化,進一步提高了骨髓染色體的制備成功率,改良方法在惡性血液病診斷中尤其在慢性粒細胞白血病(CML)的臨床應用中具有重要價值,現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2019年1月至2022年6月來清遠市人民醫院就診的355例惡性血液病患者骨髓標本(男性182例,女性173例),平均年齡58.8±14.5歲,中位年齡為60歲。結合臨床、MICM分型及張之南等[4]主編的《血液病診斷及療效標準》對患者進行診斷分型,包括99例急性髓系白血病(AML)患者,16例急性淋巴細胞白血病(ALL)患者,33例CML患者,13例慢性淋巴細胞白血病(CLL)患者,82例多發骨髓瘤(MM)患者,53例骨髓增生異常綜合征(MDS)患者,27例非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者,25例慢性骨髓增殖性疾病(CMPD)患者,7例慢性粒單細胞白血病(CMML)患者。本研究經清遠市人民醫院倫理委員會批準,患者均已簽署知情同意書。抽取患者2～5 mL骨髓標本注射到專用肝素鈉抗凝管,2 h內送檢,無溶血、無凝血、未經過高溫和冷凍且無污染樣本為合格標本。

1.2 實驗方法

1.2.1改良骨髓染色體G顯帶 本研究首先抽取16例惡性血液病患者骨髓,根據文獻報道[3,5-7]和臨床實踐經驗,在短期培養法的基礎上進行改良,分別對接種濃度、秋水仙堿濃度和作用時間、低滲、培養時間等因素進行優化改良。接種濃度方面,將每例患者的骨髓標本先經有核細胞計數,然后按照2.0×106/mL細胞密度接種;秋水仙堿方面,鑒于骨髓染色體對秋水仙堿較為敏感,將秋水仙堿使用液的濃度由10 μg/mL降為5 μg/mL,在終濃度為0.1 μg/mL條件下作用1 h;低滲液方面,將0.075 M KCl的低滲液改為0.075 M KCl與0.1%檸檬酸鈉溶液按3∶1新鮮混合的低滲液,作用30 min,進而增加染色體分散度;保持上述條件不變的情況下,對骨髓細胞的培養時間進行單因素分析,將每份標本接種4瓶,根據培養時間不同分成A、B、C、D四組,培養時間依次為16 、20 、24和28 h,其余步驟同常規染色體方法。條件優化后,所有標本均按改良后的骨髓染色體G顯帶制備方法進行。

1.2.2鏡檢與核型分析 采用德國蔡司全自動染色體掃描分析儀對骨髓染色體進行鏡檢分析,每例標本顯帶后計數20個核型分裂相,分析5個染色體核型,根據《人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN)2016》描述染色體核型,如果可分析染色體分裂相數目不足時,則分析全部染色體分裂相,出現2個以上相同染色體結構異常或數目增加異常,或是3個染色體減少異常,則判為染色體異常,每例標本有5個及以上可供分析的染色體分裂相即視為成功[5]。

1.2.3熒光原位雜交(FISH)檢測 為進一步提高CML患者診斷率,對初步診斷為CML的患者同時使用FISH檢測試劑盒進行融合基因BCR-ABL檢測,實驗方法均嚴格按照試劑盒說明書操作進行,綠色熒光標記為BCR(22q11.2)探針,紅色熒光標記為ABL(9q34)探針,BCR/ABL1融合基因顯示黃色或紅綠疊加信號(F),正常信號模式為2G2R(G為綠色信號,R為紅色信號),熒光顯微鏡下觀察200個間期細胞熒光雜交信號,根據《人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN)2016》對結果進行描述。

1.3 統計學分析

使用IBM SPSS Statistics 25統計學軟件處理實驗數據,多組實驗結果染色體分裂相均值分析采用單因素ANOVA檢驗,染色體分裂相組間兩兩比較采用t檢驗,骨髓細胞培養成功率多組比較采用卡方檢驗,Fisher確切概率法分析,P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 單因素實驗結果

改良前染色體形態欠佳、分辨率低、分散性差;改良后染色體形態、分辨率、分散性均明顯改善,可分析染色體分裂相增多(見圖1和圖2);單因素分析發現染色體分裂相均值差異有統計學意義(P<0.05),進一步兩兩對比發現,染色體分裂相值B組高于D組,差異有統計學意義(P<0.05),其他組間染色體分裂相值兩兩比較差異無統計學意義(P>0.05);培養成功率方面四組之間差異有統計學意義(P<0.05),進一步兩兩對比分析,B組的培養成功率顯著高于D組,差異有統計學意義(P<0.05),其他組間培養成功率兩兩比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1和表2。

表1 染色體分裂相數分析實驗結果

表2 染色體培養成功率分析實驗結果

圖1 改良前染色體核型圖

2.2 骨髓異常染色體檢出結果

采用改良后骨髓染色體制備方法的355例惡性血液病患者中,除12例患者不足5個染色體分裂相外,其余均一性培養成功,成功率為96.6%(343/355),異常染色體檢出率為40.3%(143/355),其中CML異常核型檢出率最高為93.9%(31/33),AML為41.4%(41/99),ALL為50%(8/16),CLL為15.4%(2/13),MM為19.5%(16/82)、MDS為64.2%(34/53),NHL為14.8%(4/27),CMPD為16.0%(4/25),CMML為42.9%(3/7)。染色體數目以+8、超二倍體(>48條)、亞二倍體(<44條)以及染色體多發異常為主,結構異常以t(9;22)、t(15;17)、t(8;21)為主,t(15;16)、t(7;18)、t(11;22)、I(17)(q10)等比較少見。不同疾病類型異常染色體分布不同,AML以t(15;17)和t(8;21)等特征性結構異常為主;CML以t(9;22)為主,ALL有3例t(9;22),2例+8異常,其余為多發異常;MM和MDS均以染色體多發異常為主,不同類型血液病異常染色體檢出率見表3。

表3 異常染色體檢出統計

2.3 CML檢出結果

33例CML患者經FISH分析,檢出BCR-ABL融合基因陽性31例,染色體核型分析檢出Ph染色體t(9;22)陽性31例,兩者檢出率一致,檢出率均為94.3%。從CML病程上來看,25例慢性期患者中Ph染色體陽性23例,加速期和急變期Ph染色體陽性檢出率均為100%,出現額外染色體3例,分別為+8、+11、+mar。另有1例隱匿型易位t(5;22)(q35;q11.2),1例復雜隱匿型易位51,XXYY,t(1;9;22)(q25;q34;q11.2),+der(9)t(1;9;22),+11,+der(22) t(1;9;22),見表4。

表4 不同病程CML異常核型檢出結果

其中1例患者診斷為CML 5年,雙下肢疼痛、乏力3個月,雙腎囊腫、脾大,外周血白細胞升高(44.5×109/L),輕度貧血(HGB 96 g/L),骨髓涂片和流式細胞學均提示CML急髓變,其中骨髓涂片原始細胞占45%,骨髓活檢提示CML急髓變(MF-3級),FISH檢測BCR-ABL融合基因陽性nuc ish(ABL1×5,BCR×4)(ABL1 con BCR×2)[92/200],骨髓染色體核型結果為51,XXYY,t(1;9;22)(q25;q34;q11.2),+der(9)t(1;9;22),+11,+der(22) t(1;9;22),為復雜隱匿型易位合并額外染色體異常(圖3:BCR-ABL融合基因檢測結果;圖4:染色體核型分析圖)。

圖3 FISH檢測結果[nuc ish(ABL1×5,BCR×4)(ABL1 con BCR×2)[92/200],注.綠色(G)為BCR(22q11.2)探針,紅色(R)為ABL(9q34)探針,黃色或紅綠疊加(F)為BCR/ABL1融合基因]

3 討論

骨髓染色體核型分析對惡性血液系統疾病的診斷分型、治療、預后判斷及發病機制的探討具有重要意義,目前骨髓染色體的制備方法主要有直接法、即刻低滲法、短期培養法和同步化法,每一方法各有優缺點,實踐表明短期培養法相對穩定、染色體分裂相多,比較適合在臨床中推廣應用[6]。然而骨髓染色體制備影響因素眾多,不可避免因細胞培養和染色體制備出現失敗。但不同實驗室在染色體制備時較難保持完全一致,且不同細胞類型疾病對制備條件也存在差異,因此在制備過程中各實驗室應根據自身實驗條件進行優化,以達到最佳制備效果,從而提高惡性血液病異常染色體核型的檢出率。

3.1 改良骨髓染色體制備方法分析

短期培養影響因素較多,本研究從接種濃度、秋水仙堿濃度和作用時間、低滲液和低滲時間等方面進行優化改良,發現接種濃度在2.0×106/mL,秋水仙堿濃度為0.1 μg/mL作用1 h,0.075 M的KCl與0.1%的檸檬酸鈉3∶1新鮮配制的低滲液在37 ℃條件下作用30 min,此時制備的骨髓染色體效果較為理想。研究表明,骨髓染色體制備與培養時間具有相關性,短期培養法時間為24～48 h,因此本研究對培養時間進行了單因素分析。按培養時間分為四組,依次為16、20、24和28 h。發現染色體培養成功率和染色體分裂相數隨著培養時間延長呈先升后降趨勢,其中B組在染色體分裂相均值、成功率方面最優,與D組相比差異有統計學意義(P=0.041,P=0.037),與A組或C組相比存在差異,但差異性不顯著,說明骨髓染色體培養在16～24 h之間為宜,20 h最為理想,不宜超過28 h,本實驗結果與文獻報道相一致[6-7]。本研究中采用改良后的骨髓染色體制備方法的355例惡性血液病患者,除12例不足5個染色體分裂相外,其余均一性培養成功,成功率高達96.6%(343/355),異常染色體核檢出率40.3%(143/355),很好的滿足了臨床對惡性血液病診斷分型的需求。

3.2 骨髓異常染色體檢出結果分析

惡性血液病是發生在骨髓中以造血干細胞異常為主的克隆性惡性疾病,其中大多數惡性血液病患者還伴隨著染色體的改變,染色體改變是影響白血病預后的獨立因素,染色體異常的類型直接關系著白血病患者的預后情況[8]。本研究發現,355例惡性血液病患者異常染色體檢出率為40.3%,與馬娟等[9]報道惡性血液病異常染色體檢出率42.5%基本一致,其中CML、MDS、ALL、CMML和AML檢出率較高,分別為93.9%、64.2%、50%、42.9%和41.4%,而MM、CMPD、CLL和NHL檢出率較低,分別為19.5%、16.0%、15.4%和14.8%,異常染色體跟不同類型血液病明顯相關,且具有一定的特異性。

研究表明,ALL出現t(9;22)比例高達20%～30%,常預后不良[10],本研究中的16例ALL患者中有7例出現異常染色體,其中t(9;22)檢出率為18.8%,與文獻報道的成人ALL出現t(9;22)約20%～30%接近[11]。AML異質性較高,伴重現性細胞遺傳學異常約30%～40%,且為多發異常[12],本實驗AML異常染色體檢出率為41.4%(41/99),其中t(15;17)檢出率最高占AML的8.1%(8/99),為AML-M3診斷分型的遺傳標志,而t(8;21)出現在AML-M2a中占4%(4/99),M2a患者伴t(8;21)對化療治療的敏感性及緩解率均較高,預后良好[13]。MDS與細胞遺傳、分子遺傳、免疫機制及骨髓微環境異常等相關,極易向AML轉化[14-15],本研究MDS異常染色體核型檢出率為64.2%,染色體以多發異常以及不平衡異常為主[15-16]。MM染色體異常多為復雜異常,常提示預后不良,本研究中MM異常染色體核檢出率為19.5%(16/82),符合文獻報道 MM 初診時染色體異常克隆的檢出率18%～35%[17],16例異常染色體中以涉及多條染色體的結構異常數目異常的復雜和高度復雜畸變為主,其中3例為-13伴有其他染色體多發異常,預后不良。CMPD、NHL和CMML異常染色體檢出率分別為16.0%(4/25)、14.8%(4/27)和42.9%(3/7),NHL表現為多發異常,其中3例出現多個標記染色體(mar),CMPD和CMML出現染色體異常以結構異常為主,少見數目異常,缺少標記性染色體異常,可能跟病例數較少有關。

3.3 CML分子遺傳和細胞學結果分析

CML是一種起源于造血干細胞的多系骨髓增生性腫瘤,其細胞遺傳學特征是t(9;22)形成一個縮短的22號染色體(Ph染色體),Ph染色體形成同時產生BCR-ABL融合基因,BCR-ABL是CML的重要診斷依據[18],Ph染色體不僅能夠對用于區分MDS、CML和類白血病,CML根據有無Ph染色體又分為Ph+型和Ph-型,Ph-型為異質性疾病,其中約50%出現BCR-ABL陽性,也屬于Ph+型CML,治療效果和預后均較差[19]。本研究33例CML患者通過兩種技術分別檢出Ph染色體和BCR-ABL融合基因31例,均為Ph+型和BCR-ABL陽性,CML中Ph染色體陽性率93.9%,與文獻報道的CML患者中Ph染色體檢出率的90%～95%一致[20],其中染色體核型分析發現3例額外異常染色體,FISH和染色體核型分析技術分別從分子遺傳和細胞遺傳學方面提供了不同的遺傳學信息,豐富了CML患者遺傳學改變的信息。

研究表明,CML患者Ph+伴額外染色體常預示著疾病向加速及急變期發展,預后較差[21]。有學者研究發現CML患者Ph+伴額外染色體其細胞生成和分子應答率明顯降低,患者應答時間延長,是伊馬替尼治療CML患者的不良預后因素之一[22]。本研究中慢性期患者無額外異常染色體,在加速期和急變期患者中,出現額外異常染色體3例,其中1例患者為CML急變期,FISH檢測BCR-ABL陽性,染色體核結果為復雜隱匿性Ph染色體合并額外染色體異常,該患者白細胞升高、輕度貧血、脾大,骨髓涂片、流式細胞學和骨髓活檢提示CML急髓變,臨床診斷為慢性粒細胞白血病急髓變,存在病情急劇進展可能,預后較差,需進一步聯合化療和骨髓移植治療,額外染色體的出現對病例惡化具有重要的預測價值,兩者聯合應用可為臨床CML診斷分型提供了更加全面的參考依據[23]。

綜上所述,本研究通過優化改良短期骨髓染色體培養方法,提高了骨髓染色體培養成功率及異常染色體檢出率,建立了適合推廣使用的骨髓染色體G顯帶制備方法;發現不同血液病染色體異常檢出率和類型也不相同,部分具有一定的特異性,骨髓染色體和FISH技術聯合應用為臨床對白血病診斷分型、治療及預后判斷提供了重要參考依據。

作者貢獻

李付廣,張曉靜等進行文章構思、設計、實施、收集并整理數據、撰寫論文;湯素環,唐江進行數據收集,統計學處理;吳愛娟進行數據質量控制;謝小雷,尹衛國進行論文的修訂、監督管理。

本文不存在任何利益沖突。