Hsa_circ_MIB1 在神經膠質瘤中的表達及臨床意義

羅伶俐,陳思敏

(1.湖南省兒童醫院 檢驗中心,湖南 長沙410007;2.湖南省益陽市中心醫院 檢驗科,湖南 益陽413099)

腦膠質瘤(Glioma)是中樞神經系統最常見的原發性腫瘤,具有高度侵襲性和較高的死亡率,容易復發且治療難度高[1-2]。環狀RNA(circRNA)是一種具有共價閉合環狀結構的新型非編碼RNA,circRNA與腫瘤、動脈粥樣硬化、糖尿病、神經系統疾病等多種疾病相關[3-4]。CircRNAs也在神經系統疾病(如膠質瘤)中發揮重要作用,如circ_0079593可通過海綿吸附miR-324-5p而促進神經膠質瘤的進展[5-6]。本研究采用circRNA高通量測序技術,篩選出膠質瘤組織與正常腦組織中的差異表達circRNAs,并擬對在膠質瘤中顯著低表達的circMIB1進行研究,揭示其與膠質瘤患者臨床病理特征的相關性,報道如下。

1 資料與方法

1.1 組織樣本與細胞收集

在中南大學湘雅醫院神經外科接受手術的患者標本共93 例,其中包括76例神經膠質瘤患者的腦組織和正常腦組織17例。癌癥組所有患者均確診為神經膠質瘤,排除合并其他惡性腫瘤患者,男38例,女38例,年齡1～71歲。正常腦組織取自癲癇和海綿狀血管瘤患者,男12例,女5例,年齡6～73歲。所有組織標本均由2名病理科醫生確認。收集的組織標本置-80℃凍存。所有患者在手術前均未接受任何抗腫瘤治療且簽署了知情同意書,此研究獲得了本院倫理委員會的認可。神經膠質細胞系HEB和神經膠質母細胞瘤細胞系U87購于上海中國科學院,神經膠質母細胞瘤細胞系U251購于美國ATCC,神經膠質母細胞瘤細胞系SF126購于北京協和醫學院細胞研究所。

1.2 總RNA的提取

參照Trizol試劑盒說明(Invitrogen,美國)提取樣本組織和細胞總RNA,采用紫外分光光度計測定樣本RNA在波長260 nm和280 nm的光密度值D260、D280,當 D260 /D280 比值在1.8 ～2.0之間時認為樣本 RNA 純度合格。

1.3 circRNA高通量測序篩選差異表達基因

委托杭州聯川生物公司對4例正常腦組織和5例腦神經膠質瘤患者組織進行高通量測序。測序完成后,通過Tophat 2進行序列比對,然后用 cufflinks 對所有基因進行定量;再使用EdgeR包進行差異分析,滿足Log2差異倍數絕對值≥1且P<0.05的基因被認為是差異基因。

1.4 RT-qPCR檢測

hsa_circ_MIB1的表達采用瑞士羅氏公司的逆轉錄試劑盒對總RNA進行反轉錄獲得cDNA。采用日本TOYOBO公司的SYBR qPCR Mix Kit進行hsa_circ_MIB1的RT-qPCR檢測,以GAPDH作為內參基因,以2-ΔΔCt作為hsa_circ_MIB1的相對表達水平。circRNA引物設計由生工生物工程(上海)股份有限公司完成,其中hsa_circ_MIB1上游引物序列為 5’-ACTGGCAGTGGGAAGATCAA-3’,下游引物序列為 3’-AGAAAGAACCTCCCTTGGCA-5’;GAPDH上游引物序列為 5’-ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA-3’,下游引物序列為 3’-ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA-5’。

1.5 circRNA穩定性檢測

首先提取細胞RNA,將RNA分為RNase 消化組和非消化組,RNase消化組按1 μg RNA用1U的RNase的比例加樣,在37℃振蕩混勻15 min,然后用苯氯仿沉淀法提取消化產物,并逆轉錄為cDNA,通過qRT -PCR 檢測目標circRNA及對應線性 mRNA 的表達水平,以非消化組為對照。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 膠質瘤組織及正常腦組織中circRNA差異表達分析

對4例正常腦組織、5例腦膠質瘤組織進行circRNA高通量測序,結果發現有1248個差異表達的circRNA分子,其中在膠質瘤中表達上調的circRNA分子有158個,表達下調的circRNA有1090個。聚類分析(圖1)結果顯示差異表達的circRNA能正確區分癌組織與正常腦組織。在測序結果中差異表達的circRNA中,隨機選擇7個表達上調的circRNA和5個表達下調的circRNA,在4例正常腦組織和5例腦膠質瘤組織中進行實時熒光定量PCR來驗證分子測序的結果。結果如圖2所示,7個circRNA明顯表達上調(P<0.05)、5個circRNA明顯表達下調(P<0.001),驗證結果與測序結果基本一致,說明測序結果可靠。

圖1 膠質瘤組織和正常腦組織中差異表達circRNAs的聚類熱圖

圖2 膠質瘤組織中測序表達上調和下調的circRNA驗證

2.2 hsa_circ_MIB1結構的鑒定

結果顯示hsa_circ_0000835(hsa_circ_MIB1)在觀察組中差異表達明顯下調,且其在膠質瘤中尚無相關研究,因此選為最終目標circRNA進行進一步驗證。hsa_circ_MIB1由其親本蛋白MIB 1(E3泛素蛋白連接酶)第2、3、4、5、6號外顯子環化而成,長度為679 bp,定位在18號染色體的19345732-19359646位置(圖3A)。根據hsa_circ_MIB1特征設計了兩組引物,一組發散引物(divergent primers)用于擴增環狀轉錄物,而另一組收斂引物(convergent primers)用于檢測線性轉錄物。用PCR分析,發現發散引物能成功地從U251細胞的cDNA中成功擴增出hsa_circ_MIB1,而基因組DNA(gDNA)則不能。相反,用收斂引物只能從cDNA和gDNA中擴增出線性轉錄物MIB1(圖3B)。在兩種神經膠質母細胞瘤細胞系 U87和U251中,使用RNase R(核糖核酸外切酶)分別處理circRNA和其線性mRNA后,結果如圖3C所示,hsa_circ_MIB1在U87和U251細胞中的表達水平無顯著差異,但其線性親本基因線性 mRNA(MIB1)被RNase R破壞后表達顯著降低(P<0.0001),說明hsa_circ_MIB1不受外切酶影響,具有環狀結構。

圖3 hsa_circ_MIB1的鑒定

2.3 hsa_circ_MIB1在膠質瘤組織和細胞中的表達情況

采用RT-qPCR法檢測了76 例神經膠質瘤患者的腦組織和17 例正常腦組織中的hsa_circ_MIB1水平。結果顯示:膠質瘤組織中hsa_circ_MIB1的表達量(0.28±0.63)明顯低于正常腦組織(1.60±1.56),差異有統計學意義(P<0.0001),見圖4A。檢測hsa_circ_MIB1在正常腦星形膠質細胞系 HEB 及惡性腦膠質瘤細胞系 U251、U87 及 SF126 中的表達,發現惡性膠質瘤細胞系中的hsa_circ_MIB1表達水平均明顯低于正常腦星形膠質細胞系中的表達水平(P<0.05),與測序結果一致(圖4B)。

圖4 膠質瘤組織和細胞中hsa_circ_MIB1的表達情況

2.4 hsa_circ_MIB1的表達水平與臨床病理特征的相關性

選擇膠質瘤組織中位表達水平作為分離閾值,將患者分為hsa_circ_MIB1低表達組(n=38)和hsa_circ_MIB1高表達組(n=38)。通過分析76例膠質瘤患者hsa_circ_MIB1表達與年齡、性別和臨床分期的關系,發現hsa_circ_MIB1的表達與膠質瘤病人的年齡和性別差異無統計學意義,與臨床分期關系密切(χ2=7.930,P<0.005)。臨床分期越高,hsa_circ_MIB1的表達水平越低(表1)。Kaplan-Meier 生存質量分析顯示hsa_circ_MIB1表達水平越低,膠質瘤患者生存期越短,說明hsa_circ_MIB1水平與膠質瘤患者的總生存時間之間存在正相關關系(P<0.0001),見圖5A。受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析結果顯示,hsa_circ_MIB1診斷的臨界值為0.8289,其對應的靈敏度和特異度分別為100.0%和82.89%,ROC曲線下面積為0.928,95%置信區間為0.855～0.9871,見圖5B。

表1 膠質瘤患者hsa_circ_MIB1的表達與臨床病理特征的關系

圖5 hsa_circ_MIB1的表達水平與其臨床病理特征的相關性分析

3 討論

腦膠質瘤是中樞神經系統常見的惡性腫瘤之一,其惡性度高、難以完全切除。即使進行手術、放化療等綜合治療,仍有較高的復發率,導致腦膠質瘤患者的五年生存率低,預后差[7]。目前膠質瘤的發病機制尚不明確,尋找膠質瘤的病因,可以早期明確診斷、控制疾病進展,并提高膠質瘤患者的治療效果。因此,深入研究膠質瘤發病的原因,篩選與神經膠質瘤相關的生物標志物和治療新靶點尤為必要。在過去的二十年中,腫瘤發生和腫瘤發育中非編碼 RNA 的異常表達和(或)功能已成為最重要的科學發現之一,如miRNA,lncRNA和circRNA[8]。circRNA是一種具有閉合環狀結構的新型非編碼 RNA,是由mRNA 前體特殊剪接、外顯子序列首尾連接構成的環狀結構。與線性 RNA 相比,circRNA具有不易被降解的穩定性與時空特異性,更有潛力成為診斷癌癥的理想生物標志物[9]。circRNA可以作為miRNA的內源性競爭RNA來影響轉錄后調控,能與相關的miRNA、mRNA 相互作用來調控疾病的進展來發揮其生物學功能[10]。近年來,大量研究證實,circRNA在乳腺癌、胃癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤中存在異常表達,通過上調原癌基因或抑癌基因進而發揮抑癌或促癌基因的作用[11-12]。新的證據表明,circRNAs在神經元組織中普遍存在[13]。然而到目前為止,膠質瘤中的大多數circRNA的確切功能仍不清楚。因此,關注circRNA在膠質瘤發病過程中的表達及作用機制,從而為膠質瘤的臨床干預及治療提供新的思路。

本研究采用了高通量測序對4 例正常腦組織和5 例腦膠質瘤組織進行了差異表達環狀RNA 的檢測,發現了1248 個差異表達的circRNA分子,其中表達上調的circRNA分子有158 個,表達下調的circRNA有1090 個。依據篩選標準找到了明顯差異表達的hsa_circ_0000835(hsa_circ_MIB1)。hsa_circ_MIB1是一種外顯子環化circRNA,由其親本蛋白MIB1(E3泛素蛋白連接酶)的第2、3、4、5、6號外顯子環化而成,長度為679bp,定位在18號染色體的19345732～19359646位置。MIB1是Notch通路激活所需的E3泛素連接酶,而Notch信號的失調與各種癌癥的細胞轉化和腫瘤發生有關。MIB1已被證實在多種疾病的發生發展中能夠扮演重要的角色,例如肺癌[14]、胰腺癌[15]和先天性心臟病[16]等,但在膠質瘤中鮮有研究。因此預測hsa_circ_MIB1可能與腦膠質瘤的發生發展有關。隨后通過RT-qPCR擴大樣本量進行驗證,發現腦膠質瘤組織中的 hsa_circ_MIB1表達水平比正常腦組織明顯下調,且具有較強的診斷效能(ROC 曲線AUC =0.928),靈敏度和特異度分別為100.0%和82.89%,具有作為膠質瘤生物診斷標志物的潛力。同樣的,腦膠質瘤細胞系中的hsa_circ_MIB1表達水平也比正常腦膠質細胞明顯下調。結合臨床病理結果進行分析,發現其低表達與膠質瘤患者的臨床分期顯著相關,差異有統計學意義(P<0.0001),與年齡、性別相關性差異無統計學意義(P>0.05),說明hsa_circ_MIB1表達水平能夠反映腫瘤的惡性程度。Kaplan-Meier生存質量分析顯示hsa_circ_MIB1 表達水平越低,膠質瘤患者生存期越短,提示hsa_circ_MIB1 可能具有抑制膠質瘤進程的作用,但有待進一步的探索。同時還對hsa_circ_MIB1進行了穩定性驗證,證實了hsa_circ_MIB1具備circRNA不易降解的特性,且成環性、穩定性優于鏈狀 RNA,從生物學角度分析更適合作為診斷膠質瘤的生物標志物。

綜上,本研究報道了hsa_circ_0000835(hsa_circ_MIB1)在膠質瘤中的生物活性,hsa_circ_MIB1在膠質瘤組織和細胞中均明顯表達下調,且與臨床分期和總生存時間有關。hsa_circ_MIB1可能作為診斷膠質瘤的分子標志物,尤其是協助診斷膠質瘤的臨床分期情況,并有很高的潛力成為治療膠質瘤的潛在靶點。