冠心病患者微小RNA及外周血T細(xì)胞表達(dá)對斑塊穩(wěn)定性的影響

齊貴彬,高建步,張明磊,張永杰,王 星,解莉莉,李京倡,劉 琳

(河南大學(xué)附屬南陽市中心醫(yī)院 心血管內(nèi)科,河南 南陽473009)

動脈粥樣硬化主要累及大、中動脈,是一種慢性血管炎性疾病[1]。目前研究認(rèn)為,動脈粥樣硬化的主要病理機(jī)制為血管內(nèi)皮功能異常導(dǎo)致血管壁粥樣硬化斑塊沉積,引發(fā)血管狹窄和閉塞[2]。微小RNA(miRNA,miR)能夠誘發(fā)血管平滑肌細(xì)胞向增殖狀態(tài)轉(zhuǎn)化,同時(shí)促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜遷移,參與動脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展[3]。近年來動物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的可能與動脈粥樣硬化有關(guān)的3種miRNA包括miR-126、miR-221、miR-155[4]。CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在維持免疫平衡狀態(tài)方面發(fā)揮重要作用,細(xì)胞高表達(dá)的CD25+Foxp3+是CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特異性標(biāo)志[5]。脂質(zhì)核心、表面內(nèi)皮、外周纖維帽共同構(gòu)成了動脈粥樣硬化斑塊,可分為脂質(zhì)成分較少,周圍以膠原組織和平滑肌細(xì)胞為主的穩(wěn)定斑塊;以及脂質(zhì)松軟且較多,斑塊纖維帽很薄,平滑肌細(xì)胞較少的不穩(wěn)定斑塊[6]。動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性直接影響到冠心病患者繼發(fā)性血栓的形成風(fēng)險(xiǎn),因此本研究探討冠心病患者miR-126、miR-221、miR-155及外周血T細(xì)胞表達(dá)對斑塊穩(wěn)定性的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2019年2月至2020年6月間河南大學(xué)附屬南陽市中心醫(yī)院心內(nèi)科收治的冠心病患者138例。入選標(biāo)準(zhǔn):冠狀動脈造影顯示1支及以上的主要冠脈狹窄程度達(dá)到III級。排除標(biāo)準(zhǔn):①有PCI手術(shù)、球囊擴(kuò)張術(shù)治療史的患者;②合并感染性疾病,自身免疫性疾病,惡性腫瘤,肝、腎功不全的患者。其中男性90例,女性48例;年齡49～67歲,平均年齡(57.28±6.50)歲。選取健康志愿者60例為對照組,男性41例,女性19例;年齡48～65歲,平均年齡(56.94±5.63)歲。一般資料在各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。此項(xiàng)研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過,患者的家屬簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1血管內(nèi)超聲檢查 向冠脈造影顯示的管腔直徑狹窄程度50%及以上的冠脈中注入200U硝酸甘油,使用超聲診斷儀和冠脈超聲成像導(dǎo)管,在X線透視下將超聲探頭導(dǎo)管沿著導(dǎo)引絲放入冠脈。到冠脈狹窄病變處遠(yuǎn)端,以0.5 mm/s的速度回撤超聲探頭導(dǎo)管,采集影像數(shù)據(jù),通過虛擬組織學(xué)技術(shù)評價(jià)斑塊性質(zhì),將冠心病患者分為穩(wěn)定斑塊組56例,不穩(wěn)定斑塊組82例。

1.2.2外周循環(huán)miR-126、miR-221、miR-155檢測 采集冠心病患者和對照組受試者清晨空腹外周靜脈血6 ml,抗凝處理后取其中4 ml分離血清和血漿,-80℃保存待測。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測血漿miR-126、miR-221、miR-155表達(dá)水平,PCR擴(kuò)增引物由上海一研生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。miR-126上游引物:5′-TAATAATGAGTGCCATGCTGAGCTC-3′,下游引物:5′-GTAATACAGTGCCATGCTTTCGAA-3′。miR-221上游引物:5′-GG AACCTGCCATAACGGACAGTCACTTTAT-3′,下游引物:5′-GAGAGCTATAA AGGCGCCACTACTATTTGA-3′。miR-155上游引物:5′-TAGAGACGGGGCG GAGACGAGCTA-

GTAA-3′,下游引物:5′-AGTATATAACCTTGTAACATTTGG TATAG-3′。人snRNAU6(內(nèi)參)上游引物:5′-TGGAGCCTGGGACGTGACCAG -3′,下游引物:5′-CGACGGCTTCGCTCGTGGGGCT-3′。PCR擴(kuò)增參數(shù):95℃ 預(yù)變性5 min、95℃ 變性30 s、60℃退火30 s,72℃延伸1 min,共30個(gè)循環(huán)。計(jì)算miR-126、miR-221、miR-155的相對表達(dá)量。

1.2.3外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測 取另外2 ml抗凝處理后的空腹外周靜脈血,Ficoll密度梯度離心分離單個(gè)核細(xì)胞,除去黏附細(xì)胞后得到總T細(xì)胞,光學(xué)顯微鏡下調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml,使用PerCP-抗CD3、FITC-抗CD4、PE-抗CD25標(biāo)記T細(xì)胞,4℃靜置30 min,使用含10%胎牛血清的磷酸緩沖液洗滌3次,加入1 ml磷酸緩沖液重懸,CD3+設(shè)門,流式細(xì)胞儀檢測CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的比例。

1.2.4血脂4項(xiàng)和血清γ干擾素(IFN-γ)水平測定 取血清標(biāo)本,全自動生化分析儀測定總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇水平,檢測試劑購于美康生物科技有限公司;酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清IFN-γ水平,試劑盒購于北京邁瑞達(dá)科技有限公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組miR-126、miR-221、miR-155表達(dá)水平比較

miR-126、miR-221、miR-155表達(dá)水平在對照組、穩(wěn)定斑塊組、不穩(wěn)定斑塊組之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與對照組比較,穩(wěn)定斑塊組、不穩(wěn)定斑塊組患者miR-126表達(dá)水平明顯降低,miR-221、miR-155表達(dá)水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);不穩(wěn)定斑塊組患者miR-126表達(dá)水平明顯低于穩(wěn)定斑塊組,miR-221、miR-155表達(dá)水平明顯高于穩(wěn)定斑塊組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組miR-126、miR-221、miR-155表達(dá)水平比較

2.2 各組CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及IFN-γ水平比較

CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的比例、血清IFN-γ水平在對照組、穩(wěn)定斑塊組、不穩(wěn)定斑塊組之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與對照組相比,穩(wěn)定斑塊組、不穩(wěn)定斑塊組患者CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的比例明顯降低,血清IFN-γ水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);不穩(wěn)定斑塊組患者CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的比例明顯低于穩(wěn)定性斑塊組,血清IFN-γ水平明顯高于穩(wěn)定性斑塊組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及IFN-γ水平比較

2.3 各組血脂水平比較

與對照組相比,穩(wěn)定斑塊組、不穩(wěn)定斑塊組患者總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇水平明顯升高,高密度脂蛋白膽固醇水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);不穩(wěn)定斑塊組患者總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平明顯高于穩(wěn)定斑塊組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組血脂水平比較

2.4 冠心病患者miR-126、miR-221、miR-155表達(dá)水平與血脂4項(xiàng)和CD4+CD25+Foxp3調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+細(xì)胞比例的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析顯示,冠心病患者miR-126表達(dá)水平與總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平呈負(fù)相關(guān),與CD4+CD25+Foxp3調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的比例呈正相關(guān)。冠心病患者miR-221、miR-155表達(dá)水平與總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇水平呈正相關(guān),與CD4+CD25+Foxp3調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)。見表4。

表4 冠心病患者miR-126、miR-221、miR-155表達(dá)水平與血脂4項(xiàng)的相關(guān)性分析

2.5 冠心病患者CD4+CD25+Foxp3調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的比例與血脂4項(xiàng)的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析顯示,冠心病患者CD4+CD25+Foxp3調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的比例與總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇水平無明顯相關(guān)性(r=-0.265、-0.207、-0.319、0.224,均P>0.05)。

3 討論

相關(guān)研究顯示,血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-126高表達(dá)與血管重塑明顯相關(guān),能夠調(diào)控單核細(xì)胞趨化蛋白、血管細(xì)胞黏附因子等靶基因的表達(dá)[7]。在大腦中動脈閉塞大鼠模型中血清miR-126表達(dá)水平明顯降低[8]。研究認(rèn)為miR-221的生物學(xué)功能存在細(xì)胞特異性,在血管內(nèi)皮細(xì)胞中能夠抑制細(xì)胞增殖和凋亡,但在血管平滑肌細(xì)胞中能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖和凋亡[9]。血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-221高表達(dá)與血管重塑明顯相關(guān),能夠調(diào)控單核細(xì)胞趨化蛋白等靶基因表達(dá),促進(jìn)不穩(wěn)定斑塊的形成[10]。miR-155與免疫系統(tǒng)功能和內(nèi)皮細(xì)胞炎性應(yīng)答明顯相關(guān),其高表達(dá)能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶(NOS)生成,進(jìn)而降低血管內(nèi)皮的舒張功能,促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊形成[11]。對動脈粥樣硬化小鼠模型研究顯示,敲除miR-155后能夠明顯縮小硬化斑塊,抑制不穩(wěn)定斑塊形成[12]。本研究結(jié)果顯示,穩(wěn)定斑塊組、不穩(wěn)定斑塊組患者miR-126表達(dá)明顯降低,miR-221、miR-155表達(dá)明顯升高;其中不穩(wěn)定斑塊組患者改變較穩(wěn)定斑塊組更明顯。提示miR-126低表達(dá),miR-221、miR-155高表達(dá)可能促進(jìn)不穩(wěn)定斑塊的形成。

慢性炎癥反應(yīng)貫穿動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展至不穩(wěn)定斑塊形成的整個(gè)過程[13]。本研究結(jié)果顯示,穩(wěn)定斑塊組、不穩(wěn)定斑塊組患者CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的比例明顯低于對照組,不穩(wěn)定斑塊組患者CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的比例明顯低于穩(wěn)定斑塊組。提示CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫調(diào)控機(jī)制參與冠心病患者動脈粥樣硬化斑塊形成過程。近年來對動脈粥樣硬化炎性反應(yīng)的T細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn),IFN-γ作為免疫活化因子,在動脈粥樣硬化發(fā)生與進(jìn)展過程中起著重要作用,包括促進(jìn)巨噬細(xì)胞分化,抑制內(nèi)皮細(xì)胞增長、平滑肌細(xì)胞的膠原合成等[14]。本研究中穩(wěn)定斑塊組、不穩(wěn)定斑塊組患者血清IFN-γ水平明顯高于對照組;不穩(wěn)定斑塊組患者血清IFN-γ水平明顯高于穩(wěn)定斑塊組。提示IFN-γ分泌量增加可能是影響斑塊穩(wěn)定性的一個(gè)重要因素。相關(guān)性分析顯示,冠心病患者miR-126表達(dá)水平與CD4+CD25+Foxp3調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的比例呈正相關(guān);miR-221、miR-155表達(dá)水平與CD4+CD25+Foxp3調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)。提示miR-126可能正向調(diào)節(jié)CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá),miR-221、miR-155負(fù)向調(diào)節(jié)CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá),進(jìn)而通過調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫抑制作用來降低冠脈中斑塊的炎癥反應(yīng),減緩斑塊向不穩(wěn)定狀態(tài)的進(jìn)展。

相關(guān)研究顯示,斑塊穩(wěn)定性與內(nèi)部脂質(zhì)含量水平密切相關(guān),降低LDL-C水平能夠有效穩(wěn)定斑塊[15]。本研究結(jié)果顯示,穩(wěn)定斑塊組、不穩(wěn)定斑塊組患者總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇水平明顯高于對照組,不穩(wěn)定斑塊組患者總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平明顯高于穩(wěn)定斑塊組,與上述研究結(jié)論一致。相關(guān)性分析顯示,冠心病患者miR-126表達(dá)水平與總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平呈負(fù)相關(guān);miR-221、miR-155表達(dá)水平與總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇水平呈正相關(guān)。提示miR-126、miR-221、miR-155在影響血管內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞趨化蛋白、血管細(xì)胞黏附因子、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等表達(dá)同時(shí),還可能通過影響冠心病患者的血脂水平來影響斑塊穩(wěn)定性,具體的分子通路仍需進(jìn)一步深入研究。