胃癌類器官的研究進展*

楊濤,陳濤,劉禮鑫,劉康,夏術(shù)森

637000 四川 南充,川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院 胃腸外二科(楊濤、陳濤、劉禮鑫、夏術(shù)森);637000 四川 南充,南充市中心醫(yī)院 組織工程與干細胞研究所(劉康)

胃癌是一種消化道常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率與死亡率高,預后差,是全球人類生命健康安全的主要威脅之一[1]。胃癌發(fā)病率在全球癌癥發(fā)病率中位居第5名,是全球第4大癌癥相關(guān)死亡原因[2]。在我國癌癥發(fā)病率中胃癌發(fā)病率位居第2名,死亡率居于第3位[3]。一項研究表明,僅2020年,全球就有770 000人死于胃癌[4]。目前胃癌的治療是以手術(shù)為主的綜合性治療,化療是其治療的重要組成部分。但由于大多數(shù)患者在就診時已是中晚期,加之腫瘤對化療藥物產(chǎn)生耐藥性等原因,導致胃癌患者總體預后不佳,給人民生命健康及社會經(jīng)濟造成沉重負擔。因此對于胃癌發(fā)生、發(fā)展機制的研究及藥物精準化治療迫在眉睫。患者來源的腫瘤類器官(patient-derived organoid,PDO)保留了原腫瘤的組織結(jié)構(gòu)特點,可反映出原腫瘤的特異性,并且PDO模型還具有遺傳穩(wěn)定性,因此可用來評估患者對臨床治療的特異性反應[5],進而為患者的個體化治療方案提供依據(jù)[6]。PDO因其獨特的特點,可在臨床工作前進行藥物實驗,避免了復雜且耗時的動物實驗。這大大地促進了腫瘤患者個體化治療方案的實施,在臨床治療及科學研究方面具有重要意義。本文就胃癌類器官的建立及其當前的研究進展,結(jié)合胃癌類器官的特點為胃癌的個性化治療提供新的研究思路。

1 類器官概述

過去胃癌的研究模型包括標準細胞系模型、動物模型、人源腫瘤細胞系移植模型及人源腫瘤組織異種移植模型等。二維培養(yǎng)的細胞系模型因獲取方便、培養(yǎng)過程簡單、成本低廉等特點,已廣泛運用于各種科學實驗中。但在連續(xù)的傳代和外界刺激因素的作用下,其染色體發(fā)生變異,原癌特性喪失,并且缺乏原癌組織的三維結(jié)構(gòu),導致無法表達出原癌組織的結(jié)構(gòu)特性[7]。動物模型組織結(jié)構(gòu)與人器官結(jié)構(gòu)差異過大,并且無法模擬疾病的轉(zhuǎn)化發(fā)生過程,極大地限制了其在科研工作中的運用及價值[8]。腫瘤異種移植模型是將腫瘤細胞或組織植入小鼠體內(nèi),盡可能地模擬了原發(fā)腫瘤在生理狀態(tài)的腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)中的變化。但由于物種及遺傳信息的差異,研究中無法準確還原腫瘤在人體內(nèi)的相互作用情況,并且構(gòu)建模型難度較大,花費較高,極大地限制了其在研究中的運用[9]。類器官是干細胞在三維空間結(jié)構(gòu)中的特定培養(yǎng)體系下自我驅(qū)動組裝形成的可在體外增殖、分化的3D結(jié)構(gòu)的細胞復合體,其細胞結(jié)構(gòu)、功能及基因組特性與原組織器官高度一致,因此常常用于器官的發(fā)育、腫瘤的發(fā)病機制、藥物篩選與開發(fā)、精準醫(yī)療等領(lǐng)域的研究。但是由于類器官的培養(yǎng)過程較復雜,培養(yǎng)周期較長且成本較高,其在科研中的應用受限。不過隨著培養(yǎng)技術(shù)的進步,類器官的培養(yǎng)及在科研方面的運用也越來越廣泛。類器官的干細胞主要來源于多能干細胞(pluripotent stem cells,PSC)和器官限制性成體干細胞(organ-restricted adult stem cells,ASCs),其中前者包括多能誘導干細胞和胚胎干細胞。PSC的分化方向具有不確定性,因此PSC來源的類器官可以根據(jù)研究人員的需要,在培養(yǎng)時通過添加不同組織類器官培養(yǎng)所需的生長因子或抑制劑來誘導干細胞沿著類似于器官發(fā)生發(fā)育的方向發(fā)生逐步分化,最終分化成研究人員所需的類器官用于實驗。PSC來源的類器官的培養(yǎng)過程較復雜、周期長、成本高并且成功率較低,主要用于研究器官生成與組織發(fā)育。ASCs來源的類器官通常直接取自已分化的人體組織或患者的病變組織,通過添加能夠維持組織正常信號調(diào)控的生長因子,使其發(fā)展成為類器官。ASCs來源的類器官培養(yǎng)周期短、培養(yǎng)過程簡單并且成功率高,通常用于組織生物學的研究,是目前最常用的類器官培養(yǎng)方式[10]。PDO可以較好保留來源腫瘤組織的異質(zhì)性,成為腫瘤相關(guān)研究可靠的研究模型。因此胃癌患者來源的類器官在我們探索胃癌的發(fā)病機制、研究胃癌基因變化特點、胃癌患者治療藥物的研發(fā)、胃癌患者個體化治療等領(lǐng)域有著重要的價值[11-12]。

2 胃癌類器官的建立

患者來源的胃癌類器官的培養(yǎng)是將手術(shù)切下的腫瘤組織、內(nèi)鏡獲取的腫瘤組織或轉(zhuǎn)移的腫瘤組織放入到消化培養(yǎng)基中消化,獲取胃癌干細胞,當在鏡下可觀察到單個的細胞或小細胞團時終止消化[13-14],避免因過度消化導致細胞活性降低。將獲取的干細胞與基質(zhì)膠按一定比例混合重懸,然后加入含有各種生長因子的培養(yǎng)基[15-16]。經(jīng)過3～4天時間,發(fā)展成由胃干細胞、黏液細胞、主細胞、壁細胞和內(nèi)分泌細胞所包圍的球囊結(jié)構(gòu)。類器官通過不斷地增殖與傳代,用于相應的試驗檢測或者冷凍備用[17]。目前胃癌類器官還可通過小鼠來建立。Seidlitz等[18]構(gòu)建了不同亞型的胃癌轉(zhuǎn)基因小鼠,經(jīng)過培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)來源于不同基因亞型的小鼠胃癌類器官對不同藥物有明顯的耐藥性,這說明了小鼠胃癌類器官用于醫(yī)學研究是具有可行性,同時也證明了胃癌類器官的來源可以是多樣化的(圖1)。

圖1 胃癌類器官是干細胞在三維培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)形成的球囊狀結(jié)構(gòu)

3 胃癌類器官的應用

目前胃癌類器官主要應用領(lǐng)域包括探究胃癌的發(fā)病機制、臨床用藥指導、模擬TME、藥物篩選與開發(fā)(圖2)。

圖2 胃癌類器官的常見應用領(lǐng)域包括基礎研究和作為臨床疾病模型

3.1 探索胃癌的發(fā)生機制

探索在腫瘤發(fā)生過程中起到關(guān)鍵作用的基因及其功能,對于揭示胃癌的發(fā)生有非常重要的意義。過去一般通過細胞系或轉(zhuǎn)基因小鼠來研究腫瘤相關(guān)基因及其功能。轉(zhuǎn)基因小鼠試驗一般花費的時間較長、成本高,并且無法進行連續(xù)試驗,試驗過程很難把控。腫瘤細胞系試驗采用標準化的細胞系,細胞基因構(gòu)成復雜且有大量的變異基因,難以分離出單個基因進行研究,因此不太適用于腫瘤發(fā)生機制的研究。但腫瘤類器官可彌補以上不足,用于研究腫瘤的發(fā)生機制。國內(nèi)研究學者[19]通過胃癌腹水成功建立腹水來源的胃癌類器官,發(fā)現(xiàn)胃癌患者腹水的上清液可以激活腹水來源的胃癌類器官和胃癌細胞的Wnt/β-catenin信號通路,且胃癌類器官的生長與Wnt/β-catenin信號通路的激活呈正相關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn),當Wnt信號存在時,Axin/APC/GSK-3β復合物將會被Dishevelled 蛋白所抑制,使得β-catenin無法被磷酸化降解,非磷酸化β-catenin將被轉(zhuǎn)運入核,調(diào)節(jié)靶基因的表達。根據(jù)STAT3激活可增加β-catenin在細胞核中的定位,因此推斷出STAT3信號通路與Wnt/β-catenin信號通路可能在促進胃癌細胞的生存和轉(zhuǎn)移過程中起協(xié)同作用。日本學者[20]通過基因技術(shù)結(jié)合人胃上皮類器官探究了胃癌發(fā)生過程中有關(guān)基因的影響。CDH1又名上皮細胞鈣粘連素,是一種重要的細胞黏附相關(guān)基因,在維持上皮形態(tài)功能方面具有重要意義,除此之外還發(fā)揮抑癌基因功能。研究者采用 CRISPR-Cas9技術(shù)將CDH1基因敲除后,發(fā)現(xiàn)正常胃類器官由“管狀”變?yōu)椤皩嵭那驙睢?這與人類低分化彌漫型胃癌組織學形態(tài)類似。除此之外,細胞的運動能力在CDH1基因敲除后明顯增強,這也符合彌漫型胃癌中的癌細胞的特征。為了進一步研究,研究者敲除了CDH1下游基因CTNNA1,類器官的變化與CDH1基因敲除后的變化一致,最終證實了CDH1基因在胃癌的發(fā)生中起到關(guān)鍵作用。除此之外,有研究通過構(gòu)建胃癌類器官,并在胃癌類器官中過表達環(huán)狀RNA NRIP1(circRNA NRIP1,circNRIP1)。發(fā)現(xiàn)circNRIP1通過吸附miR-149-5p來調(diào)節(jié)胃癌細胞中AKT1的表達,進而調(diào)節(jié)胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲行為。當circNRIP1在人胃癌組織中顯著上調(diào)時,circNRIP1吸附 miR-149-5p 促進胃癌細胞中AKT1的表達,導致胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力增強。并且還發(fā)現(xiàn)circNRIP1可以通過胃癌細胞之間的外泌體通訊傳播,并且外泌體circNRIP1可以進一步促進體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移。這表明circNRIP1在胃癌的發(fā)生和向遠處轉(zhuǎn)移的過程中起到重要的促進作用,提示circNRIP1在未來可能成為治療胃癌的重要靶點,為胃癌的治療提供了新的思路[21]。綜上所述,胃癌類器官用于胃癌發(fā)病機制的研究是具有重要價值的。

3.2 胃癌類器官用于臨床用藥指導

日本學者利用胃癌類器官詳細地研究了EGFR通路[20],證明了EGFR通路在臨床治療中的意義。EGFR是重要的腫瘤通路,具有靶向治療價值。研究者通過構(gòu)建胃癌類器官,發(fā)現(xiàn)單個ERBB3或PTEN突變的胃癌類器官在沒有生長因子EGF和FGF10的環(huán)境中無法生長,但是ERBB2或ERBB3擴增的胃癌類器官則可以在沒有EGF和FGF10的環(huán)境中生長。使用ERBB激酶抑制劑處理后,發(fā)現(xiàn)大部分ERBB基因擴增型胃癌類器官的增殖受到抑制。除此之外,一些ERBB基因組沒有發(fā)生改變且能在缺乏EGF和FGF10的環(huán)境中生長的胃癌類器官,它們卻對ERBB激酶抑制劑敏感。通過基因組學分析發(fā)現(xiàn),可能是因為這些類器官能夠自分泌 Epireg-ulin的原因,導致了這一現(xiàn)象的發(fā)生。同時研究還發(fā)現(xiàn),MET擴增的胃癌類器官對MET抑制劑克唑替尼敏感。德國學者根據(jù)全基因組測序所得的基因突變及藥物靶點信息研究發(fā)現(xiàn),ERBB2擴增的類器官對抗ERBB2抗體曲妥珠單抗反應良好;c-KIT基因突變的類器官對伊馬替尼較為敏感;CDKN2A缺失的類器官則對靶向細胞周期的CDK4/6抑制劑palbociclib明顯耐藥[12]。香港的學者通過培養(yǎng)對5-氟尿嘧啶和順鉑具有耐藥性的胃癌類器官進行研究發(fā)現(xiàn)RNA編輯酶1(ADAR1)在胃癌類器官中上調(diào),增加了SCD1 mRNA穩(wěn)定性,而SCD1會促進脂滴的形成,減輕化療誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激,并通過增加 β-連環(huán)蛋白的表達來增強自我更新,從而對5-氟尿嘧啶和順鉑產(chǎn)生抗性。揭示了ADAR1/SCD1軸可作為預測化療預后效果的指標,這可為臨床患者篩選敏感化療藥物提供新的思路[22]。Steele等[6]建立了7例胃癌患者來源的類器官, 基因測序結(jié)果顯示胃癌患者來源類器官的基因組信息與原腫瘤組織高度相似。采用臨床常用化療藥物表阿霉素、奧沙利鉑以及5-氟尿嘧啶等對構(gòu)建的胃癌類器官進行干預, 并將干預結(jié)果與患者本人對這幾種化療藥物的治療效果進行比較,發(fā)現(xiàn)兩者的結(jié)果走向基本一致。除此之外,另有研究表明患者的放化療反應與腫瘤類器官對化療藥物的反應是高度匹配的,準確性為84.43%,敏感性為78.01%,特異性為91.97%。這些研究表明類器官可以預測腫瘤特異性反應的強度[23],證明了患者來源的胃癌類器官可幫助臨床醫(yī)生預測患者個體對化療藥物的敏感性,進而為患者制定更加有效的個體化治療方案,提高治療的針對性,最大限度地延長患者的生存期[24-25],這對胃癌患者的治療具有非常積極的作用。以上研究結(jié)果充分表明胃癌類器官可在臨床治療工作中起到重要的指導作用。

3.3 探索胃癌與TME之間的聯(lián)系

TME是指腫瘤的發(fā)生、生長及轉(zhuǎn)移時所處的內(nèi)外環(huán)境,主要由腫瘤細胞、基質(zhì)細胞、免疫細胞、內(nèi)皮細胞等組成,與腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及藥物反應密切相關(guān)[26]。二維培養(yǎng)的細胞系無法表征腫瘤細胞間的信號傳導及聯(lián)系,無法模擬出TME在腫瘤發(fā)生、生長及轉(zhuǎn)移過程中所發(fā)揮的作用。腫瘤動物實驗能夠模擬出TME,但是難以對微環(huán)境中某單一因子進行調(diào)控,并且物種差異過大[27],故在研究TME方面存在缺陷。已知細胞程序性死亡受體1(programmed cell death protein-1,PD-1)和程序性細胞死亡配體1(programmed cell death ligand 1,PD-L1)之間的相互作用可以抑制CD8+細胞毒性T細胞的增殖、存活及其功能。癌細胞通過表達與免疫細胞上的PD-1相互作用的PD-L1來逃避免疫監(jiān)視,進而導致癌細胞增殖。Chakrabarti等[28]通過將免疫細胞與小鼠來源的胃癌類器官進行共培養(yǎng)模擬胃癌微環(huán)境,研究PD-1與PD-L1之間的相互作用。最終目標是使腫瘤類器官/免疫細胞共培養(yǎng)作為臨床前模型來預測個體患者的免疫治療效果。眾所周知,胃癌是由多種因素作用下導致的惡性疾病,其中幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,HP)感染被認為是誘導胃癌發(fā)生的首要獨立危險因素[29]。經(jīng)典的散發(fā)性胃癌致病學說認為,HP感染胃黏膜后可引起慢性胃炎、胃黏膜萎縮、腸上皮化生,最終導致胃癌的發(fā)生。過去的細胞系實驗無法培養(yǎng)出胃壁細胞和黏液腺細胞,而HP感染后主要病理改變?yōu)楸诩毎撀?因此過去的實驗模型難以用于探索HP感染胃粘膜導致胃癌發(fā)生的具體過程。胃類器官可彌補細胞系的不足,為研究HP感染導致胃癌發(fā)生提供有效研究模型。研究人員將HP微注射入胃類器官空腔中,模擬胃感染HP后宿主細胞與細菌間的相互作用,成為揭示HP誘發(fā)胃黏膜免疫炎癥反應、腺體萎縮機制以及炎癌轉(zhuǎn)化過程演變規(guī)律的有力工具[30-31]。另有研究表明,只有一小部分感染了HP的人會發(fā)生胃癌,這可能是由于遺傳因素和/或宿主、微生物和環(huán)境決定因素之間的特定相互作用導致的結(jié)果。研究人員通過利用胃類器官與HP共培養(yǎng)實驗,發(fā)現(xiàn)攜帶毒力因子的細胞毒素相關(guān)基因a(cagA)的HP菌株與缺乏cagA基因的HP菌株相比,會極大地增加胃癌發(fā)生的風險。其可能的原因是CagA與ASPP2(p53-2的凋亡刺激蛋白)的結(jié)合會使感染的細胞易于失去其細胞極性并獲得由CagA與Par1b的相互作用促進的EMT樣表型,最后導致胃癌的發(fā)生[32]。綜上,胃癌類器官用于探索胃癌與TME之間的關(guān)系以及揭示HP感染在胃癌發(fā)生過程中所導致的病理變化是具有重要意義的。

3.4 藥物篩選與開發(fā)

過去藥物篩選主要通過傳統(tǒng)腫瘤細胞培養(yǎng)和人源腫瘤異種移植(patient-derived tumor xenograft,PDTX)。傳統(tǒng)的二維腫瘤細胞無法模擬出腫瘤組織結(jié)構(gòu)與TME的動態(tài)變化,缺乏機體與細胞之間的相互作用,其數(shù)據(jù)可靠性不高。PDTX可以模擬出機體與細胞間相互作用過程,但是構(gòu)建模型過程復雜,耗時長,成本高,并且存在物種差異,限制了其在藥物篩選領(lǐng)域的使用。腫瘤是一種復雜且高異質(zhì)性的疾病,因此建立生理、病理以及臨床藥物反應層面與腫瘤患者相近的模型, 對于藥物潛在效果的評估以及對患者自身救治的有效性等至關(guān)重要[33]。PDO可保留腫瘤的遺傳信息特點及生理、病理特異性,因此腫瘤類器官可以更準確地反映出這些癌癥的遺傳特征來彌合體外和體內(nèi)模型之間的差距[34],建立大型腫瘤類器官生物庫作為活體生物庫并結(jié)合藥物篩選可能是未來腫瘤新的治療策略[35]。除此之外類器官構(gòu)建時間短、花費低,有效性高,并且適合基因操作,是大規(guī)模高通量藥物篩選及新藥開發(fā)的理想模型[36]。Seidlitz等[12]將5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、伊立替康、多西他賽和表柔比星分別作用于胃癌類器官,并記錄了胃癌類器官對每種藥物的反應情況。發(fā)現(xiàn)ERBB2基因擴增的1例 PDO僅在高濃度時對5-氟尿嘧啶顯示出反應,且僅對伊立替康無抗性,在其他藥物作用下時無明顯反應,表現(xiàn)出明顯的抗性。Li等[37]用惡性腹腔積液腫瘤細胞建立了11個胃癌轉(zhuǎn)移的胃癌類器官,用奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶、順鉑、多西他賽、 伊立替康、表柔比星和紫杉醇對胃癌類器官進行藥物篩選,每種藥物以6個不同濃度進行作用,測試藥物的半數(shù)抑制濃度,判斷藥物的敏感性。結(jié)果顯示,對于胃癌惡性腹腔積液和胃癌轉(zhuǎn)移性疾病都能成功地用類器官進行藥物篩選。另有研究人員通過將胃癌類器官與免疫細胞共培養(yǎng)進行實驗,發(fā)現(xiàn)抑制HER2過表達導致PD-L1表達減少,可以減少腫瘤細胞免疫逃避。結(jié)果證明了靶向HER2的藥物可以通過降低PD-L1的表達從而創(chuàng)造一個有利于腫瘤免疫治療的環(huán)境[38]。以上實驗結(jié)果表明,用腫瘤類器官進行藥物篩選對于腫瘤患者的個性化治療具有重要價值。

4 胃癌類器官的優(yōu)缺點

胃癌類器官相較于其他研究模型而言,其主要的優(yōu)點在于其具有前瞻性、精準性及高效性。類器官作為近10年來最熱門的醫(yī)學研究領(lǐng)域之一,科研人員對其進行了大量的研究,使其成為臨床前腫瘤相關(guān)研究的理想模型,已有大量研究人員通過培養(yǎng)胃癌類器官用于揭示胃癌發(fā)生的機制及制定個體化的治療方案。另外胃癌具有高度異質(zhì)性,不同患者對同一藥物的敏感性不同并且患者經(jīng)過藥物治療后會對之前敏感的藥物產(chǎn)生耐藥性,因此治療前對患者進行藥物敏感性測試是非常有意義的。傳統(tǒng)的藥物篩選方式因其自身缺陷導致篩選出的藥物價值低且成本高昂,除此之外測試周期也很長,導致臨床運用受到極大的限制。胃癌類器官作為藥物篩選模型,不但建模時間短,并且準確性高,能表現(xiàn)出患者對藥物的真實反映,在精準醫(yī)療方面具有極高的價值。

雖然胃癌類器官這項新興技術(shù)相較于傳統(tǒng)的細胞系模型和動物模型有一定優(yōu)勢,但是也存在一些不足之處。主要的不足之處包括類器官的培養(yǎng)方式及技術(shù)問題、共培養(yǎng)問題、微環(huán)境組成問題等。第一,目前對于胃癌類器官的培養(yǎng)方式及后期類器官質(zhì)量評估方面國內(nèi)外沒有統(tǒng)一標準,導致不同實驗室有不同的標準,使得后期的研究結(jié)果存在偏差。除此之外,與其他腫瘤不同,胃癌類器官的培養(yǎng)成功率相對較低,在胃癌類器官的既往文獻報道中成功率較高的也僅僅只有50%左右[39];第二,由于胃癌類器官主要由主細胞、壁細胞、干細胞及多種內(nèi)分泌細胞所構(gòu)成,缺乏神經(jīng)、血管及機體內(nèi)的免疫細胞和寄生細菌,在探究胃癌細胞與TME間的相互作用時需進行共培養(yǎng),由于培養(yǎng)體系存在差異,進行共培養(yǎng)時不同培養(yǎng)體系間存在干擾。除此之外將胃癌類器官與TME共培養(yǎng)時間是有限的,如何解決共培養(yǎng)間的干擾和長期培養(yǎng)問題是亟待解決的;第三,目前類器官技術(shù)難以完全重現(xiàn)機體內(nèi)部復雜的生理調(diào)控過程[40],如何培養(yǎng)出具有血管、神經(jīng)系統(tǒng)的形體更大、結(jié)構(gòu)功能更復雜的胃癌類器官也是亟待解決的問題。但隨著生物技術(shù)的發(fā)展進步,我們可以通過三維生物打印技術(shù)利用各種生物材料來完成人類設計的三維骨架的構(gòu)建[41]。因此,3D生物打印技術(shù)可以人為控制類器官的3D結(jié)構(gòu),這為未來類器官的運用提供了技術(shù)支持。

5 展 望

胃癌類器官可以在體外模擬出胃癌在體內(nèi)的動態(tài)病理變化。通過向胃癌類器官空腔中注射HP,模擬出宿主細胞與寄生細菌間的相互作用,在探究HP在胃癌發(fā)生過程中所扮演的角色方面有重要意義。胃癌類器官不但具有保留原癌的特異性,并且能夠維持基因組的穩(wěn)定性,因此可作為探究胃癌的發(fā)病機制,篩選個體化治療藥物,模擬機體內(nèi)TME的重要工具,為臨床的靶向治療及精準治療提供有效的指導意義。此外,胃癌類器官的構(gòu)建成本低并且能夠大規(guī)模培養(yǎng),在高通量藥物篩選方面具有難以比擬的優(yōu)勢,這在解決臨床耐藥問題及新藥研發(fā)方面具有重要價值。當然,胃癌類器官也有不足之處,相信隨著技術(shù)的成熟完善,在腫瘤機制的研究及指導精準治療領(lǐng)域胃癌類器官將得到廣泛的應用。

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