不同等級(jí)徑山茶特征香氣成分分析

張匯源 馬寬 高婧 金俞谷 王玉潔 蘇祝成 寧井銘 陳紅平 侯智煒

收稿日期：2023-10-08 ????????????修訂日期：2023-11-16

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32302608）、浙江農(nóng)林大學(xué)科研發(fā)展基金人才啟動(dòng)項(xiàng)目（2022FR025）、徑山茶國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)全產(chǎn)業(yè)鏈標(biāo)準(zhǔn)化示范基地項(xiàng)目（TRIKJ2023070）、國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃資助（202310341070）

作者簡(jiǎn)介：張匯源，女，本科在讀，從事茶葉品質(zhì)分析方面研究。*通信作者：thean27@tricaas.com；houzhiweitea@163.com

摘要：為深入探究不同等級(jí)徑山茶的香氣差異，采用攪拌棒吸附萃取-氣相色譜-質(zhì)譜-聯(lián)用技術(shù)（SBSE-GC-MS）、頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HS-SPME-GC-MS）以及氣相色譜-嗅聞分析技術(shù)（GC-O）對(duì)特級(jí)、一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)徑山茶的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析。從4個(gè)等級(jí)的徑山茶中共鑒定出161種揮發(fā)性化合物。通過(guò)主成分分析（PCA）和聚類(lèi)分析（HCA）揭示了不同等級(jí)的徑山茶之間的差異。運(yùn)用正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）的變量投影重要性（VIP）確定不同等級(jí)茶葉樣品間的候選差異揮發(fā)物并通過(guò)相對(duì)香氣活度值（ROAV）和GC-O的分析進(jìn)一步對(duì)差異化合物進(jìn)行篩選。18種揮發(fā)性化合物，芳樟醇、香葉醇、吲哚、（Z）-茉莉酮、二甲基硫醚等物質(zhì)被鑒定為不同等級(jí)徑山茶的關(guān)鍵差異揮發(fā)性化合物。其中，二氫芳樟醇、茉莉酸甲酯和吲哚在特級(jí)徑山茶樣品中的含量顯著高于其他等級(jí)，并與（Z）-茉莉酮、δ-癸內(nèi)酯和1-辛烯-3-醇等香氣活性物質(zhì)共同構(gòu)成了特級(jí)徑山茶樣品中清花香的特征香氣品質(zhì)。本研究揭示了不同等級(jí)徑山茶的特征性揮發(fā)物具有顯著差異，從化學(xué)計(jì)量學(xué)和多元統(tǒng)計(jì)分析的角度為綠茶的等級(jí)區(qū)分提供參考。

關(guān)鍵詞：徑山茶；茶葉香氣；茶葉等級(jí)；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；氣相色譜-嗅覺(jué)計(jì)

中圖分類(lèi)號(hào)：S571.1；TS272.5+1? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ?文章編號(hào)：1000-369X（2024）01-101-18

Analysis of the Major Characteristic Aroma Compounds in Different Grades of Jingshan Tea

ZHANG Huiyuan1， MA Kuan2， GAO Jing3， JIN Yugu1， WANG Yujie3， SU Zhucheng1，

NING Jingming3， CHEN Hongping4*， HOU Zhiwei1*

1. College of Tea Science and Tea Culture， Zhejiang A&F University， Hangzhou 311300， China; 2. Hangzhou Jingshan Wufeng Tea Co.， Ltd， Hangzhou 311123， China; 3. State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization， Anhui Agricultural University， Hefei 230036， China; 4. Tea Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 310008， China

Abstract： To characterize the difference of odorants among different grades of Jingshan tea， we investigated the super grade， the first grade， the second grade and the third grade of Jingshan tea by stir bar sorptive extraction gas chromatography-mass spectrometry （SBSE-GC-MS）， headspace solid-phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry （HS-SPME-GC-MS） and gas chromatography-olfactometry （GC-O） analysis. Herein， we detected and identified 161 volatile organic compounds. The differences between the four grades of Jingshan tea were revealed by principal component analysis （PCA） and hierarchical cluster analysis （HCA）. The variable importance in projection （VIP） of the orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA） was used to determine candidate differential volatile compounds among tea samples of different grades and further screening of differential compounds was carried out through analysis of relative odor activity value （ROAV） and GC-O analysis. A total of 18 volatile compounds were identified as key odorants for the discrimination of different grades of Jingshan tea， including linalool， geraniol， indole， （Z）-jasmone， dimethyl sulfide， etc. Among them， the contents of hoterienol， methyl jasmonate， and indole in the super grade Jingshan tea were significantly higher than those in other grades， and together with （Z）-jasmone， δ-decalactone， and 1-octen-3-ol and other aroma-active compounds constitute the characteristic floral aroma of super grade Jingshan tea samples. This study revealed significant differences in the characteristic volatile compounds among different grades of Jingshan tea， providing a reference for distinguishing the grades of green teas by chemometrics combined with multivariate statistical analysis.

Keywords： Jingshan tea， tea aroma， tea quality grade， GC-MS， GC-O

徑山茶是中國(guó)傳統(tǒng)名優(yōu)綠茶地理標(biāo)志產(chǎn)品，產(chǎn)自杭州市余杭區(qū)特定區(qū)域[1]。由徑山1號(hào)、徑山2號(hào)和鳩坑種等茶樹(shù)品種鮮葉為原料，按殺青→理?xiàng)l→揉捻→干燥或殺青→揉捻→干燥等工藝制成。徑山茶品質(zhì)特征為外形細(xì)嫩顯毫，色澤綠翠，香氣持久，滋味甘醇鮮爽，湯色嫩綠明亮，葉底細(xì)嫩成朵[2]。

綠茶品質(zhì)特征關(guān)鍵指標(biāo)為外形、湯色、香氣、滋味和葉底，而香氣和滋味尤為重要[3]。綠茶特征香氣輪廓是決定茶葉等級(jí)的關(guān)鍵參數(shù)[4]，分析綠茶香氣基礎(chǔ)物質(zhì)與等級(jí)之間的關(guān)聯(lián)性有利于充分挖掘綠茶香氣特征，為綠茶分等分級(jí)提供重要依據(jù)，同時(shí)為提高綠茶香氣品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

近年來(lái)，關(guān)于茶葉中國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品的質(zhì)量?jī)?yōu)劣、真?zhèn)蔚葐?wèn)題逐漸受到廣泛關(guān)注，尤其是產(chǎn)品所具有的特征性品質(zhì)指標(biāo)的解析判別[5]。針對(duì)不同等級(jí)名優(yōu)茶的特征性香氣成分的鑒定和評(píng)價(jià)等研究也備受關(guān)注[6]。研究表明，盡管不同等級(jí)的茶葉在化學(xué)成分方面十分相似，但是化學(xué)組分及濃度的細(xì)小差異會(huì)導(dǎo)致其品質(zhì)風(fēng)味產(chǎn)生較大差別。Su等[7]基于GC-MS、感官評(píng)價(jià)和化學(xué)計(jì)量學(xué)解析了不同等級(jí)的祁門(mén)紅茶的香氣組分，Han等[8]基于LC-MS的代謝組學(xué)和感官評(píng)價(jià)揭示了不同等級(jí)黃山毛峰綠茶的關(guān)鍵化合物，這些研究對(duì)于揭示不同等級(jí)茶葉的特征性品質(zhì)差異，以及客觀判別茶葉品質(zhì)優(yōu)劣提供了科學(xué)依據(jù)。然而，目前在不同等級(jí)徑山茶香氣成分的鑒定及其關(guān)鍵呈味物質(zhì)的解析等方面尚缺少深入的研究。

攪拌棒吸附萃取（SBSE）因其良好的重復(fù)性和較低的檢測(cè)限而受到關(guān)注，是一種高效萃取技術(shù)，目前被廣泛應(yīng)用于茶葉香氣的提取[9]，對(duì)揮發(fā)性化合物和半揮發(fā)性化合物均有很好的萃取效果[10]。頂空固相微萃取（SPME）作為另一種簡(jiǎn)單、高效、快速的萃取方法，更適用于低分子量、高揮發(fā)性化合物的萃取[11-12]。為更全面提取茶葉中的揮發(fā)性物質(zhì)，將SPME和SBSE相結(jié)合可以更精確地描述整體的香氣輪廓。GC-O-MS是一種將GC-MS和人類(lèi)嗅覺(jué)相結(jié)合的方法，已被廣泛應(yīng)用于食品風(fēng)味的分析，該分析方式在識(shí)別復(fù)雜混合物中香氣活性化合物的貢獻(xiàn)方面十分有效，通過(guò)GC-O試驗(yàn)鑒定出的揮發(fā)性化合物可認(rèn)為是茶葉的關(guān)鍵香氣化合物[12-13]。Marsili等[14]研究顯示，SBSE在萃取揮發(fā)性化合物的數(shù)量方面比SPME更有優(yōu)勢(shì)，為確保更多的揮發(fā)性物質(zhì)能被嗅探到，采用攪拌棒吸附萃取-氣相色譜嗅覺(jué)測(cè)定-質(zhì)譜聯(lián)用（SBSE-GC-O-MS）的方法進(jìn)一步確認(rèn)香氣活性物質(zhì)。

本研究參照徑山茶的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[15]，從徑山茶的原產(chǎn)地收集4個(gè)不同等級(jí)的樣品，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）和SBSE-GC-O-MS技術(shù)對(duì)不同等級(jí)徑山茶的揮發(fā)性化合物進(jìn)行分析鑒定，探究4個(gè)等級(jí)徑山茶的香氣組成。由于本研究采用癸酸乙酯內(nèi)標(biāo)法對(duì)不同等級(jí)的徑山茶樣品進(jìn)行相對(duì)定量，因此采用相對(duì)氣味活度值（ROAV）評(píng)估各化合物對(duì)整體香氣的具體貢獻(xiàn)。較高的ROAV表明了某種組分對(duì)樣品整體風(fēng)味的重要貢獻(xiàn)。ROAV≥1的組分通常被認(rèn)為是分析樣品的關(guān)鍵香氣化合物[16]，ROAV＜1的揮發(fā)性化合物則對(duì)徑山茶的整體香氣貢獻(xiàn)較小。本研究通過(guò)計(jì)算揮發(fā)性化合物的ROAV，結(jié)合GC-O結(jié)果篩選出關(guān)鍵香氣化合物，并綜合感官審評(píng)，探究其特征性香氣成分，揭示不同等級(jí)徑山茶的揮發(fā)性化合物組成差異。旨在進(jìn)一步豐富徑山茶風(fēng)味化學(xué)物質(zhì)理論，填補(bǔ)不同等級(jí)徑山茶揮發(fā)性物質(zhì)研究的空白，為加工生產(chǎn)中提高徑山茶香氣品質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)，并為其他品類(lèi)的綠茶等級(jí)評(píng)價(jià)判定提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所用4個(gè)等級(jí)的徑山茶樣品由杭州徑山五峰茶業(yè)有限公司提供，以鳩坑群體種茶樹(shù)鮮葉為原料，經(jīng)過(guò)攤放→殺青→理?xiàng)l→揉捻→干燥的工藝流程加工，并按照徑山茶的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GH/T 1127—2016進(jìn)行等級(jí)區(qū)分[9]。茶樣密封后置于–4 ℃保存待測(cè)。

正構(gòu)烷烴（C6～C40）混合物購(gòu)自上海Sigma-Aldrich公司；氯化鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蒸餾水購(gòu)自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；癸酸乙酯（99%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，無(wú)水乙醇購(gòu)自天津大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

SPME手動(dòng)進(jìn)樣器、DVB/CAR/PDMS（50/30 μm）固相微萃取頭，美國(guó)Supelco公司；PDMS磁力攪拌轉(zhuǎn)子、ODP3嗅覺(jué)檢測(cè)口，德國(guó)Gerstel公司；DF-101S型磁力攪拌水浴鍋，上海力辰邦西儀器科技有限公司；Agilent7890B-5977B、Agilent8890B-5977B氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、DB-5MS、HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、10 μL手動(dòng)進(jìn)樣針，美國(guó)Agilent公司。

1.3 試驗(yàn)方法

稱(chēng)取3.00 g茶樣于250 mL錐形瓶中，加入60 mL沸水沖泡5 min，將茶湯經(jīng)400目紗布過(guò)濾至另一錐形瓶中，并立即將濾液置于冰水浴中快速冷卻至室溫，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.1 HS-SPME-GC-MS方法

HS-SPME-GC-MS方法參考Huang等[17]方法并進(jìn)行了適當(dāng)修改。將10 mL制備好的茶湯轉(zhuǎn)移至20 mL頂空瓶中，隨后將3 g氯化鈉、4 μL質(zhì)量濃度為10 mg·L-1的癸酸乙酯作為內(nèi)標(biāo)加入茶湯，并加入磁力轉(zhuǎn)子使揮發(fā)物充分揮發(fā)。將頂空瓶置于50 ℃恒溫水浴鍋中，平衡15 min后，插入SPME萃取針吸附40 min，萃取結(jié)束后取出萃取頭，插入GC-MS進(jìn)樣口，在250 ℃的條件下解吸附5 min。

GC-MS分析：DB-5MS氣相色譜柱；升溫程序?yàn)?0 ℃保持5 min，以2 ℃·min-1的速率升至70 ℃，隨后以3 ℃·min-1的速率升至120 ℃，之后以10 ℃·min-1的速率升至260 ℃保持2 min；載氣為氦氣（99.99%）；MS采用正離子模式；質(zhì)量掃描范圍為m/z 30～400；電子能量為70 eV；進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣。

1.3.2 SBSE-GC-O-MS方法

SBSE-GC-O-MS方法參考Wang等[18]的研究并進(jìn)行了修改。將10 mL制備好的茶湯轉(zhuǎn)移至20 mL頂空瓶中，加入3 g氯化鈉，隨后將頂空瓶置于50 ℃恒溫水浴鍋中平衡15 min，加入4 μL質(zhì)量濃度為10 mg·L-1的癸酸乙酯和PDMS磁力攪拌吸附轉(zhuǎn)子，將頂空瓶置于磁力攪拌器吸附90 min后取出轉(zhuǎn)子，使用純凈水洗凈攪拌轉(zhuǎn)子表面殘留的物質(zhì)，擦干后置于氣相瓶中，利用熱脫附單元對(duì)攪拌子吸附的物質(zhì)進(jìn)行解吸附。

GC-MS分析條件：HP-5MS色譜柱；升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0 ℃保持5 min，以3 ℃·min-1的速率升至100 ℃，隨后以2 ℃·min-1的速率升至130 ℃，之后以10 ℃·min-1的速率升至250 ℃保持5 min；載氣為氦氣（99.99%）；MS采用正離子模式；質(zhì)量掃描范圍為m/z 30～350；電子能量為70 eV。

GC-O-MS將分析柱流出物等分為兩份，分別流向MS端（250 ℃）和嗅聞口（230 ℃）。由3名經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的評(píng)估人員在GC-O的嗅聞口進(jìn)行嗅聞。評(píng)估人員記錄香氣特征，按照1～4分的4級(jí)評(píng)分法進(jìn)行氣味強(qiáng)度評(píng)分。其中，1分表示氣味較弱，2分表示氣味適中，3分表示氣味較強(qiáng)，4分表示氣味極強(qiáng)。香氣強(qiáng)度最終評(píng)定結(jié)果為3個(gè)成員的算數(shù)平均值，重復(fù)3次。

1.3.3 揮發(fā)性化合物的定性定量分析

根據(jù)GC-MS分析得到的各色譜峰，通過(guò)正構(gòu)烷烴（C6～C40）的保留時(shí)間（RT）計(jì)算所有檢測(cè)到的揮發(fā)性成分的保留指數(shù)（RI），結(jié)合NIST17標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索，對(duì)比相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)[19]的RI值對(duì)化合物定性，并采用癸酸乙酯內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行相對(duì)定量。SBSE和SPME都萃取到的揮發(fā)性化合物采用SBSE的定量結(jié)果用于后續(xù)的多元統(tǒng)計(jì)分析。

ROAV值的確定：OAVi=Ci/OTi，ROAVi=OAVi×（OTmax/Cmax）×100，其中Ci為揮發(fā)性化合物的相對(duì)含量，OTi為揮發(fā)性化合物的氣味閾值，OTmax為OAV值最大的揮發(fā)性化合物的氣味閾值，Cmax為OAV值最大的揮發(fā)性化合物的相對(duì)含量[16]。

1.3.4 感官審評(píng)方法

參照GB/T 23776—2018《茶葉感官審評(píng)方法》[20]對(duì)不同等級(jí)的徑山茶進(jìn)行審評(píng)，由5位經(jīng)驗(yàn)豐富的茶葉審評(píng)員組成的審評(píng)小組對(duì)各等級(jí)徑山茶樣品進(jìn)行綜合評(píng)判，5項(xiàng)因子得分為百分制，按照加權(quán)法計(jì)算總分（總分＝外形×0.25＋湯色×0.10＋香氣×0.25＋滋味×0.30＋葉底×0.10）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26.0進(jìn)行方差分析，使用SIMCA 14.1進(jìn)行主成分分析和正交偏最小二乘判別（OPLS-DA）分析，使用TBtools和Origin 2022繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官審評(píng)

對(duì)不同等級(jí)的徑山茶樣品進(jìn)行感官審評(píng)，其香氣感官特征及評(píng)分結(jié)果如表1所示。從審評(píng)結(jié)果看，特級(jí)樣品具有最高的香氣評(píng)分，清花香持久，香氣特征明顯，整體表現(xiàn)最優(yōu)。其次是一級(jí)，具有嫩清香，香氣的持久性不如特級(jí)，而二級(jí)、三級(jí)樣品香氣的飽滿(mǎn)程度和持久性均低于特級(jí)和一級(jí)樣品。

2.2 徑山茶揮發(fā)性物質(zhì)的構(gòu)成分析

采用GC-MS對(duì)4個(gè)等級(jí)徑山茶的揮發(fā)性成分進(jìn)行初步鑒定，并使用內(nèi)標(biāo)（癸酸乙酯）進(jìn)行相對(duì)定量，以探究樣品間總揮發(fā)性成分的相對(duì)濃度差異。如表2所示，采用兩種方法共鑒定出161種揮發(fā)性化合物，其中SPME萃取方法檢測(cè)到89種，SBSE萃取方法檢測(cè)到106種。如圖1所示，特級(jí)、一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)的茶樣中分別檢測(cè)到111、108、105、115種揮發(fā)性化合物，包括9個(gè)酸類(lèi)，41個(gè)醇類(lèi)，22個(gè)醛類(lèi)，24個(gè)烯類(lèi)，8個(gè)芳香族類(lèi)，18個(gè)酯類(lèi)，6個(gè)雜環(huán)類(lèi)，22個(gè)酮類(lèi)，4個(gè)內(nèi)酯類(lèi)，6個(gè)酚類(lèi)，1個(gè)其他類(lèi)（二甲基硫醚）。4個(gè)等級(jí)的共有揮發(fā)物有74種。所有樣品檢測(cè)到的化合物以醇類(lèi)、酮類(lèi)、酯類(lèi)和醛類(lèi)為主，其中醇類(lèi)的占比最大，醇類(lèi)和醛類(lèi)物質(zhì)占總揮發(fā)性成分含量的一半以上（圖2）。而不同類(lèi)別的化合物在不同等級(jí)樣品之間的含量及占比均存在差異。

2.3 徑山茶中差異揮發(fā)性化合物分析

為了揭示不同等級(jí)徑山茶的揮發(fā)性化合物的差異，本研究對(duì)GC-MS測(cè)得的揮發(fā)物進(jìn)行PCA分析（圖3）。由圖3可知，同一等級(jí)的茶樣聚集在一起，而不同等級(jí)的茶樣則明顯分離。HCA的結(jié)果顯示，特級(jí)和一級(jí)樣品分別單獨(dú)聚為一類(lèi)，二級(jí)和三級(jí)的樣品聚為一類(lèi)。PCA得分圖顯示了樣品間揮發(fā)性成分的差異，HCA樹(shù)狀結(jié)構(gòu)表明這些樣品具有獨(dú)特的特征，這些結(jié)果均表明4個(gè)不同等級(jí)徑山茶的揮發(fā)性化合物存在一定差異。

為進(jìn)一步衡量每一個(gè)揮發(fā)性化合物對(duì)不同等級(jí)分類(lèi)的貢獻(xiàn)，本研究采用了OPLS-DA模型，對(duì)試驗(yàn)樣品進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型X軸方向累積解釋率R2X=0.949，Y軸方向累積解釋率R2Y=0.997，模型累積預(yù)測(cè)率Q2=0.994。為驗(yàn)證模型的有效性，對(duì)模型進(jìn)行了200次置換檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，R2=0.155，Q2=–0.8，未出現(xiàn)過(guò)擬合現(xiàn)象，表明以檢測(cè)出的揮發(fā)性化合物為自變量，可對(duì)不同等級(jí)的徑山茶樣品進(jìn)行較好的分離和預(yù)測(cè)。為了進(jìn)一步了解區(qū)分不同等級(jí)茶樣的關(guān)鍵揮發(fā)物，計(jì)算了所有變量的VIP值，運(yùn)用單因素方差分析（ANOVA）的鄧肯檢驗(yàn)，篩選了32個(gè)VIP＞1，P＜0.05的差異化合物，并繪制熱圖以直觀地展示這些重要揮發(fā)性成分在不同等級(jí)中的含量變化。如圖4所示，不同等級(jí)的徑山茶樣品的主要揮發(fā)性化合物不同，紅色表示高于平均濃度，藍(lán)色表示低于平均濃度。特級(jí)茶樣中的二氫芳樟醇、茉莉酸甲酯、1-辛烯-3-醇、壬醛和2，4-二叔丁基苯酚的含量均高于其他等級(jí)，（Z）-3-己烯-1-醇、2-己烯醛、（E）-2-己烯醛在一級(jí)茶樣中含量較高，芳樟醇、β-紫羅酮、香葉醇、苯乙醇和（Z）-茉莉酮等物質(zhì)在二級(jí)茶樣中含量較高，1-己醇、二甲基硫醚等在三級(jí)茶樣中含量較高。

2.4 關(guān)鍵呈香物質(zhì)的篩選分析

為了更深入了解徑山茶的氣味特征和關(guān)鍵香氣化合物的強(qiáng)度，本研究圍繞4個(gè)等級(jí)的茶樣對(duì)采用SBSE方法提取的揮發(fā)性化合物進(jìn)行了GC-O-MS分析。在4個(gè)等級(jí)的徑山茶樣品中共檢測(cè)到45個(gè)香氣強(qiáng)度在3～4的化合物，并通過(guò)保留時(shí)間、保留指數(shù)進(jìn)一步鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如表3所示。鑒定出的化合物大部分呈現(xiàn)出花香和清香，如芳樟醇、二氫芳樟醇、香葉基丙酮、（Z）-3-己烯-1-醇等；少部分呈現(xiàn)出青氣等令人不愉悅的氣味，如己醛、苯乙醛等。

特定化合物對(duì)不同茶葉樣品的整體香氣貢獻(xiàn)還取決于其相對(duì)香氣活度值（ROAV）。如表4所示，本研究共篩選出15種ROAV≥1的揮發(fā)性化合物，在特級(jí)和一級(jí)樣品中有13種，二級(jí)和三級(jí)樣品中有8種。β-紫羅酮、芳樟醇、（E，E）-2，4-庚二烯醛對(duì)茶葉的清花香屬性有主要貢獻(xiàn)[24]，香葉醇是果香的主要來(lái)源。此外，己醛的ROAV值也較高，是茶葉青氣的主要來(lái)源。

為了更全面地評(píng)定關(guān)鍵呈香物質(zhì)，本研究綜合了VIP＞1、ROAV≥1以及GC-O≥3的嗅聞結(jié)果，進(jìn)一步篩選差異化合物，最終確定了區(qū)分4個(gè)等級(jí)徑山茶樣品的18個(gè)關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)，如圖5所示。二氫芳樟醇（清花香）、茉莉酸甲酯（花香、甜香）、吲哚（茉莉花香）在特級(jí)中的含量顯著高于其他等級(jí)，并與（Z）-茉莉酮、δ-癸內(nèi)酯、1-辛烯-3-醇等香氣活性物質(zhì)共同構(gòu)成徑山茶清花香的特征性香氣品質(zhì)，也是特級(jí)茶樣香氣評(píng)分較高的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)。在一級(jí)茶樣中，（Z）-3-己烯-1-醇（清香）的含量較高；二級(jí)茶樣中，香葉醇（果香）、β-紫羅酮（花香）、芳樟醇（清花香）、芳樟醇氧化物類(lèi)（甜香）的含量顯著高于其他等級(jí)，由于芳樟醇氧化物類(lèi)的存在，二級(jí)茶樣除了清香外，與其他等級(jí)茶樣相比還有較為明顯的甜香；在三級(jí)茶樣中，1-己醇、二甲基硫醚含量較高，在高濃度下，二甲基硫醚具有谷物香，而1-己醇具有較濃的青氣，這可能是三級(jí)茶樣中存在令人不愉悅氣味的主要原因。

在篩選出的18個(gè)關(guān)鍵物質(zhì)中，大部分都是具有花香、清香或者果香的揮發(fā)性化合物，多為令人愉悅的香氣，而（Z）-3-己烯-1-醇（青氣）、1-辛烯-3-醇（蘑菇味）、1-己醇（青氣）具有令人不愉悅的氣味。根據(jù)Ho等[25]的報(bào)道，以糖苷類(lèi)物質(zhì)作為前體生成的芳樟醇及其氧化產(chǎn)物、香葉醇和苯乙醇等揮發(fā)性物質(zhì)是綠茶香氣的關(guān)鍵成分。徑山茶加工過(guò)程中，殺青、理?xiàng)l和干燥過(guò)程中的高溫都能有效破壞糖苷鍵，從而提高了茶葉中上述物質(zhì)的含量[26]。其中芳樟醇、苯乙醇和壬醛是徑山茶清香和花香

的主要貢獻(xiàn)者，而對(duì)果香和甜香有主要貢獻(xiàn)的主要是芳樟醇氧化物類(lèi)和香葉醇。β-紫羅酮是茶葉加工過(guò)程中β-胡蘿卜素?zé)峤到猱a(chǎn)生的揮發(fā)物，已被確定為綠茶花香的關(guān)鍵貢獻(xiàn)物質(zhì)[12，22]。（Z）-3-己烯-1-醇豐富了茶葉中的清香，它可由亞油酸和α-亞麻酸通過(guò)自由基引發(fā)的氧化反應(yīng)和脂肪氧化酶介導(dǎo)的脂質(zhì)氧化反應(yīng)產(chǎn)生[25]。（Z）-3-己烯-1-醇通常在高濃度時(shí)呈現(xiàn)青氣，隨著濃度的降低，清香逐漸突出[27]。

茉莉酸甲酯、（Z）-茉莉酮是由茶葉中α-亞麻酸在酶的催化下氧化降解產(chǎn)生的茉莉酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化而來(lái)的代表性香氣物質(zhì)。有研究表明，茉莉酸甲酯是茶葉中蘭花香氣的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)，茶葉采摘后，有關(guān)茉莉酸甲酯合成的內(nèi)源酶被激活，茉莉酸甲酯的含量在萎凋、揉捻的過(guò)程中不斷積累[28]。

較低濃度的吲哚具有茉莉花的香味，吲哚是色氨酸吲哚裂解酶催化色氨酸氧化的產(chǎn)物，該反應(yīng)通常發(fā)生在茶葉采摘前和采摘后的脅迫過(guò)程中。徑山茶在加工過(guò)程中的攤放步驟可能激活了鮮葉的脅迫響應(yīng)，進(jìn)而促使吲哚含量升高[29-30]。水楊酸甲酯具有薄荷、冬青的氣味，可通過(guò)β-葡萄糖苷酶等的水解反應(yīng)產(chǎn)生[31-32]。徑山茶的攤放過(guò)程也可能是水楊酸甲酯產(chǎn)生的重要途徑。不同等級(jí)徑山茶鮮葉原料在嫩度上具有一定的差異，這可能是導(dǎo)致不同等級(jí)徑山茶中吲哚及水楊酸甲酯含量不同的原因之一。此外，內(nèi)酯類(lèi)化合物香氣柔和，留香持久，在很多水果中均有存在，同時(shí)這類(lèi)化合物與其他化合物具有協(xié)同作用，能夠增強(qiáng)其他化合物的芳香氣味[33]。徑山茶中檢測(cè)出的δ-癸內(nèi)酯可能與其他揮發(fā)性化合物共同構(gòu)成了徑山茶的香氣品質(zhì)特征。二甲基硫醚可由高溫過(guò)程中S-甲基蛋氨酸的熱降解產(chǎn)生，在一定程度上有利于綠茶鮮香的形成[27]。

3 討論

吲哚是促進(jìn)植物生長(zhǎng)和保護(hù)植物所必需的植物化學(xué)物質(zhì)[34]。有研究指出，茶葉原料越嫩，成品茶中吲哚的含量越多[35-36]。根據(jù)徑山茶的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，特級(jí)徑山茶的鮮葉采摘標(biāo)準(zhǔn)為一芽一葉的細(xì)嫩芽頭，這可能導(dǎo)致特級(jí)茶樣中的吲哚含量顯著高于其他等級(jí)樣品，特級(jí)樣品的花香屬性較強(qiáng)。

δ-癸內(nèi)酯具有椰奶香，是茶葉中一種重要的內(nèi)酯類(lèi)化合物[33]。特級(jí)徑山茶中δ-癸內(nèi)酯的含量高于其他等級(jí)，并可能與其他揮發(fā)性化合物共同增強(qiáng)了特級(jí)樣品中的清花香。Zhang等[37]的研究表明，幼嫩的茶葉中高濃度的茉莉酸甲酯對(duì)茶葉組織具有保護(hù)作用，由于特級(jí)樣品的鮮葉原料較為細(xì)嫩，其茉莉酸甲酯和（Z）-茉莉酮的含量較高，進(jìn)一步提升了特級(jí)茶樣中的清香和花香。（Z）-3-己烯-1-醇的存在能豐富茶葉的清香[27]，由于徑山茶一級(jí)茶樣中（Z）-3-己烯-1-醇的含量相對(duì)較高，因此可能增強(qiáng)了其清香特征及香氣的持久性。

徑山茶中香葉醇、苯乙醇、β-紫羅酮、芳樟醇及其氧化產(chǎn)物等揮發(fā)性物質(zhì)，可能是在殺青、理?xiàng)l和干燥過(guò)程的高溫作用下產(chǎn)生。此外，由于徑山茶鮮葉原料等級(jí)的不同，殺青、理?xiàng)l以及干燥的溫度等均有差異，而二級(jí)的原料相對(duì)較成熟，理?xiàng)l所需時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，干燥時(shí)火功較高，可能提高了上述物質(zhì)的含量[25]。此外，在二級(jí)茶樣中含量較高的水楊酸甲酯可能對(duì)清香的形成具有一定貢獻(xiàn)。

綜上所述，本研究利用化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法對(duì)不同等級(jí)徑山茶的揮發(fā)性化合物進(jìn)行鑒定，證實(shí)了不同等級(jí)徑山茶的香氣輪廓有顯著差異，并通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析綜合ROAV及GC-O的嗅聞結(jié)果篩選并確定了對(duì)徑山茶等級(jí)有顯著貢獻(xiàn)的18個(gè)關(guān)鍵揮發(fā)性化合物，分別為芳樟醇、香葉醇、吲哚、（Z）-茉莉酮、二甲基硫醚、δ-癸內(nèi)酯、茉莉酸甲酯、壬醛、水楊酸甲酯、二氫芳樟醇、β-紫羅酮、（Z）-3-己烯-1-醇、1-己醇、（Z）-芳樟醇氧化物（呋喃型）、（E）-芳樟醇氧化物（吡喃型）、（E）-芳樟醇氧化物（呋喃型）、1-辛烯-3-醇、苯乙醇。然而，本研究采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)徑山茶中的揮發(fā)性化合物進(jìn)行了相對(duì)定量，還需要探索更加完善的方法進(jìn)行絕對(duì)定量，以獲得更加準(zhǔn)確的香氣活度值。此外，由于茶葉中的揮發(fā)性化合物之間還存在著復(fù)雜的協(xié)同或拮抗作用，因此，篩選出的關(guān)鍵揮發(fā)性化合物對(duì)徑山茶香氣品質(zhì)的綜合貢獻(xiàn)及其在加工過(guò)程中的形成調(diào)控還有待進(jìn)一步探究。本研究結(jié)果有助于進(jìn)一步豐富徑山茶風(fēng)味化學(xué)物質(zhì)理論，為加工生產(chǎn)中提高徑山茶香氣品質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)，也為其他品類(lèi)的綠茶等級(jí)評(píng)價(jià)判定提供理論參考。

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