結(jié)合科研背景對試題深入分析
——以2023年廣東卷20題為例

裴 柳

(河北省石家莊市第一中學(xué))

結(jié)合真實、適切的科研背景,依托科學(xué)實驗和探究情境所命制的試題,有利于全面考查學(xué)生的科學(xué)思維,如2023年廣東高考卷第20題。教師講評本題從突變體研究背景的視角,結(jié)合真實的實驗對該題進行分析,有助于學(xué)生理清思路、突破疑難。

【原題呈現(xiàn)】種子大小是作物重要的產(chǎn)量性狀。研究者對野生型擬南芥(2n=10)進行誘變,篩選到一株種子增大的突變體。通過遺傳分析和測序,發(fā)現(xiàn)野生型DAI基因發(fā)生一個堿基G到A的替換,突變后的基因為隱性基因,據(jù)此推測突變體的表型與其有關(guān),開展相關(guān)實驗。回答下列問題:

(1)擬采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將野生型DAI基因轉(zhuǎn)入突變體植株,若突變體表型確由該突變造成,則轉(zhuǎn)基因植株的種子大小應(yīng)與________植株的種子大小相近。

(2)用PCR反應(yīng)擴增DAI基因,用限制性核酸內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物和________進行切割,用DNA連接酶將兩者連接。為確保插入的DAI基因可以正常表達,其上下游序列需具備________。

(3)轉(zhuǎn)化后,T-DNA(其內(nèi)部基因在減數(shù)分裂時不發(fā)生交換)可在基因組單一位點插入也可以同時插入多個位點。在插入片段均遵循基因分離及自由組合定律的前提下,選出單一位點插入的植株,并進一步獲得目的基因穩(wěn)定遺傳的植株(如圖1),用于后續(xù)驗證突變基因與表型的關(guān)系。

圖1

①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化T0代植株并自交,將T1代種子播種在選擇培養(yǎng)基上,能夠萌發(fā)并生長的陽性個體即表示其基因組中插入了________。

②T1代陽性植株自交所得的T2代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基,選擇陽性率約________%的培養(yǎng)基中幼苗繼續(xù)培養(yǎng)。

③將②中選出的T2代陽性植株________(填“自交” “與野生型雜交”或“與突變體雜交”)所得的T3代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基,陽性率達到________%的培養(yǎng)基中的幼苗即為目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植株。

為便于在后續(xù)研究中檢測該突變,研究者利用PCR擴增野生型和突變型基因片段,再使用限制性核酸內(nèi)切酶X切割產(chǎn)物,通過核酸電泳即可進行突變檢測,相關(guān)信息如圖2,在電泳圖(圖3)中將酶切結(jié)果對應(yīng)位置的條帶涂黑。

圖2

圖3

參考答案：(1)野生型 (2)載體 啟動子和終止子 (3)①DAI基因和卡那霉素抗性基因 ②75 ③自交 100 見圖4

圖4

在分析該題時,往往會產(chǎn)生諸多疑惑,如:“目的基因穩(wěn)定遺傳的植株”與野生型表型相同,為什么還要進行轉(zhuǎn)基因培育和篩選該類型植株?為什么導(dǎo)入目的基因的同時還要導(dǎo)入卡那霉素抗性基因?T2代和T3代培養(yǎng)基都有陽性率約100%的幼苗,為什么不是從T2代而是從T3代挑選?這些問題雖然沒有被命題人設(shè)置為考查角度,但是從突變體的科研視角對其分析和釋疑有利于開拓思路,提升學(xué)生分析和解答問題的能力,同時讓學(xué)生感受到科研工作所具有的嚴密的思維和嚴謹?shù)膽B(tài)度。

疑點1.為什么自然界中有野生型還要通過基因工程將DAI基因?qū)腚[性突變體中?

該試題相關(guān)背景是對擬南芥突變體的科學(xué)研究。其研究思路:首先對野生型擬南芥進行誘變(實驗室常用甲基磺酸乙酯作為誘變劑對擬南芥的種子進行誘變),以種子的大小為觀察指標(biāo),篩選出突變體。在科研中通常采用高通量測序法(一次并行對幾十萬至幾百萬DNA分子進行序列測定)對相關(guān)品系擬南芥的全部基因進行測序,通過數(shù)據(jù)分析,找出突變體中發(fā)生改變的基因——突變的DAI基因,然后對該基因的遺傳信息進行研究,確定了突變是由正常基因的一個堿基G替換為A所致。進而通過雜交實驗明確了該突變?yōu)殡[性突變。研究至此只是初步證實了突變體的形成與DAI基因發(fā)生隱性突變有關(guān)。為進一步增加其可信度,明確該基因與突變性狀的關(guān)聯(lián)性,科學(xué)研究中通常還需進行恢復(fù)實驗。

該突變體的恢復(fù)實驗是將單一DAI基因轉(zhuǎn)入突變體基因組中,若將正常DAI基因記作M,突變的DAI基因記作m,需先篩選出基因型為Mm的植株,其自交后得到基因型為MM的品系即為恢復(fù)系。恢復(fù)實驗的設(shè)計思路類似“某種元素是植物必需元素的驗證實驗”:在植物缺素培養(yǎng)出現(xiàn)缺素癥后,再添加該元素,觀察缺素癥是否得到明顯緩解。

突變體在自然界中很常見,在遺傳學(xué)研究中更是被廣泛應(yīng)用,如擬南芥超過90%的基因都具有突變體。在突變體研究中,恢復(fù)系植株具有重要用途,如利用恢復(fù)系和野生型分別對目的基因進行PCR,獲得該基因拷貝數(shù),若比對結(jié)果極其接近或基本一致,就可從基因數(shù)量水平證明突變體是野生型的兩個目的基因均發(fā)生隱性突變所致;在每批突變體材料的表型觀察或進行其他實驗時,需要野生型和恢復(fù)系分別做對照,故有必要篩選出能穩(wěn)定遺傳的恢復(fù)系植株并對其進行擴大培養(yǎng)。

疑點2.為什么導(dǎo)入目的基因的同時還要導(dǎo)入卡那霉素抗性基因?如何保證兩個基因同時導(dǎo)入和表達?

利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法進行轉(zhuǎn)基因時,只有農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的T-DNA片段才能轉(zhuǎn)入到受體細胞的染色體中。用于篩選擬南芥細胞、植株或種子的標(biāo)記基因也需要和目的基因一并導(dǎo)入受體中。該試題中的卡那霉素抗性基因作為標(biāo)記基因,通過在培養(yǎng)基中添加卡那霉素選擇出導(dǎo)入目的基因的種子。

為了使兩個基因均構(gòu)建在T-DNA片段中,可將兩基因進行拼接,該過程如圖5所示。獲取拼接基因需設(shè)計兩對引物,引物A、B為常規(guī)引物,且這對引物位于兩基因的非拼接端,而引物C、D位于兩基因的拼接端,且在這對引物的5′端增加一段互補序列。這樣PCR1和PCR2的產(chǎn)物,可以通過引物C、D的互補序列進行配對,使前兩輪復(fù)制得到的兩條DNA單鏈分別作為PCR3的“模板和引物”,擴增出拼接基因。之后將拼接基因?qū)朕r(nóng)桿菌T-DNA的相應(yīng)啟動子和終止子之間,借助農(nóng)桿菌的侵染將拼接基因連接到擬南芥染色體上,實現(xiàn)DAI基因和卡那霉素養(yǎng)抗性基因在受體細胞中共同表達。

圖5

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的擬南芥(T0代)中有多種基因型:沒有發(fā)生轉(zhuǎn)化的mm基因型、插入一個位點的Mm基因型、插入兩個位點的MM基因型、插入三個位點的MMM基因型等。這些種子播種在含有卡那霉素選擇培養(yǎng)基上,基因型為mm的陰性植株不能萌發(fā),而能夠萌發(fā)并生長的陽性個體基因組中均插入了M基因,借此操作篩選出導(dǎo)入目的基因的植株。

疑點3.為什么從T3代種子中挑選目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植物而非從T2代種子中挑選?

這里涉及題目(3)①-③中所述每一代操作的主要目的和株系育種法。株系是由同一植株繁殖而來的后代。通常做法是選擇某植株單株收獲種子,播種在一個單獨區(qū)間,這個區(qū)間所有植株稱為一個株系。與普通雜交育種相比,分株系種植可盡快達到鑒定和分離純系的目的。

該試題中擬選出單一位點插入的植株,并獲得純合體。結(jié)合題目信息分析T0→T1代的目的是篩選出插入了拼接基因的植株;T1→T2代目的是篩選出插入單一位點的植株:T2代種子陽性率為3/4的種子即為插入單一位點的植株,其T0代插入位置有兩種可能,如圖6中圖a和圖b所示,此時將T2代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基中,所得T3代株系全部為陽性表型,即為想篩選的突變體恢復(fù)系。

圖6

疑點4.為什么選單一位點插入野生型DAI基因的突變體?

該試題中用單一位點插入野生型DAI基因的突變體,到T3代可選出基因型為MM的恢復(fù)系。如果轉(zhuǎn)入兩個或兩個以上M基因(如圖7),因自交后代均為陽性,而無法區(qū)分導(dǎo)入M基因的個數(shù)。

圖a

同時由于基因的拷貝數(shù)可能會影響基因的表達進而影響對性狀的控制,因此篩選出和野生型一致的轉(zhuǎn)基因純合體,即通過篩選單一位點插入野生型DAI基因的突變體,進一步獲得的基因型為MM品系(恢復(fù)系)才最符合科研需求。

除了上述所呈現(xiàn)的問題,相關(guān)科研背景還可從以下角度切入:利用“不同濃度的卡那霉素對擬南芥萌發(fā)的影響”等與該試題中實驗密切相關(guān)的一系列實驗,學(xué)習(xí)獲得擬南芥突變株的常用方法[如通過甲基磺酸乙酯誘變(ems)法誘變、利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)誘變等],以及利用PCR、RT-PCR 等方法對突變體進行分子水平鑒定的流程等。

教學(xué)雖然不是科研,但了解科研背景和科研事實,學(xué)習(xí)實驗方法,不僅可以在分析試題時清楚了解出題背景和命題立意,透徹地解析疑點,還能通過科研視角的切入和科研意識的滲透,在學(xué)生心中埋下科研的種子。