葉綠素提取實驗中無水碳酸鈉作用初探

王國賢 吳紅勝 李勝杰

(1.廣東省深圳市第二高級中學 2.華中師范大學第一附屬中學 3.長江大學)

在2019版人教版高中生物教材“綠葉中的色素提取和分離”實驗中,材料用具提供的是無水乙醇,同時括號中注明:也可用體積分數95%的乙醇加入適量無水碳酸鈉來代替。為何用95%的乙醇作為提取劑時要建議加入無水碳酸鈉呢?加入和不加入無水碳酸鈉的差別有多大?筆者通過查閱相關資料和開展具體實驗,對上述問題作如下研究。

1.葉綠素結構、性質及提取原理分析

綠色植物含有大量的葉綠素a和葉綠素b,在藍細菌中還含有葉綠素c和葉綠素d。葉綠素分子主要是由4個吡咯環連接形成的卟啉環大環構成,此外還有1個副環結構,鎂離子位于大環中央,葉綠醇尾與Ⅳ吡咯環上的丙酸連接,構成完整的葉綠素分子。不同種類葉綠素分子其取代基或雙鍵類型不同。

其長鏈疏水的葉綠醇尾結構是葉綠素分子溶于乙醇、丙酮、石油醚等有機溶劑,而不溶于水的原因,同時也是葉綠素分子能夠分布于由磷脂分子構成的類囊體薄膜上的原因。類胡蘿卜素同樣不溶于水,但能溶于有機溶劑。

分離葉綠素等色素正是利用這些色素分子能夠溶于有機溶劑而不溶于水的原理,將色素與其他物質分離開。通過研磨破壞細胞內部結構,釋放出色素后,色素溶于乙醇等有機溶劑,再過濾掉殘渣,就能得到粗提取的色素。同樣,層析時所用試劑也須是有機溶劑:不同色素在層析液中的溶解度不同,擴散速度不同,從而將色素分離。需要說明的是,并非所有的色素都是脂溶性色素,例如存在于液泡中的花青素就是水溶性色素,該色素的提取就不能使用有機溶劑。

由于乙醇和水能以任意比互溶,而色素不溶于水,因此當提取物中有水存在時,會降低葉綠素在酒精中的溶解度,進而影響提取效果。需要注意的是,由于細胞中含量最多的化合物是水,因而由于水的存在而導致的色素提取損失是不可避免的。同一株植物的不同葉片、葉片的不同位置,含水量均存在一定差異,提取效率也自然存在差異。依據該理論,加入無水碳酸鈉除去部分水分有助于提高色素提取效果,但也有研究認為過量的碳酸鈉很容易造成堿性過大,進而破壞色素分子。

2.不同教材和文獻中葉綠素提取方法的比較

筆者比較了人教版、滬科版、北師大版、蘇教版、浙科版高中生物教材(均為2019版),色素提取方法基本相同,除人教版中提出“可用體積分數95%的乙醇加入適量無水碳酸鈉來代替”之外,其他教材均未提出這一觀點。其中,浙科版教材與其他版本教材在色素提取方法上有較大差異。該教材所用提取試劑正是95%的乙醇,不同的是,其實驗材料不是用新鮮葉片,而是將葉片烘干并粉碎成干粉后再進行提取。

筆者同時查閱了相關文獻,有大量實驗直接采用95%的乙醇作為葉綠素提取劑。此外,也有多種提取方法提取效果比較研究的文章,但未找到用過濾法提取色素,分別以無水乙醇、95%乙醇和95%乙醇+無水碳酸鈉作為提取劑時,分析比較提取效果的研究文章。

3.不同提取劑提取色素含量的比較

為了弄清無水乙醇、95%乙醇、95%乙醇+無水碳酸鈉三者在提取葉綠素時是否存在差異,筆者利用三種提取試劑,按照人教版高中生物教材提供的方法步驟,分別提取了菠菜葉片色素,并利用分光光度計檢測并計算了葉綠素含量。

為了減少測量和計算誤差,稱取的葉片重量均控制在0.2 g左右,所選取的葉片位置和顏色相當,每種提取試劑做3個實驗重復,共9組實驗。利用不同試劑提取后分別定容至25 mL,再從25 mL中取5 mL稀釋至25 mL,在波長665 nm和649 nm處測量各組提取液的吸光度,根據朗伯比爾定律,依據如下公式(Arnon公式修改而來)計算葉綠素濃度,并計算平均值。

葉綠素a含量=(13.95A665-6.88A649)25*5/(1000 m)

葉綠素b含量=(24.96A649-7.32A665)25*5/(1000 m)

其中:A665和A649是待測液在波長665 nm和649 nm處的吸光度,25為過濾所得溶液總量,5為稀釋倍數,m為稱取的葉片質量。所測結果如表和圖所示。

不同提取劑提取的葉綠素含量(單位:mg/g)

不同提取劑提取的葉綠素含量(單位:mg/g)

通過表格數據和柱狀圖可以比較直觀地看出,以無水乙醇和95%乙醇+無水碳酸鈉作為提取劑時,兩組在提取的葉綠素總量、葉綠素a含量和葉綠素b含量上差異不大,而只用95%乙醇作為提取試劑時,葉綠素含量(包括葉綠素a含量和葉綠素b各自含量)均較其他兩組要低。

選取葉綠素a作為比較對象,通過t檢驗做差異分析,以無水乙醇和95%乙醇+無水碳酸鈉作為提取劑時,兩者葉綠素a含量之間無顯著差異,以95%乙醇和95%乙醇+無水碳酸鈉作為提取劑時,兩者葉綠素a含量之間存在極顯著差異(P<0.01)。

4.討論

通過分析實驗原理和進行具體實驗,結果表明,添加無水碳酸鈉的確有助于提高色素的提取效果。無論是95%的乙醇中的水,還是細胞中本身的水,都會造成葉綠素的損失,降低葉綠素的提取效果。

實驗啟示,在保證色素不被破壞的情況下,確實可以通過一定的方法(如浙科版教材采用的適當溫度烘干、加入無水碳酸鈉等)來減少水分對色素提取的影響。但事實上,95%的乙醇同樣可以用來提取色素,而非某些教輔資料中所述“不能采用95%乙醇提取色素”。雖然與加入無水碳酸鈉的95%乙醇提取劑相比,在提取效果上存在一定差異,但在高中色素層析實驗中,可以通過多畫幾次濾液細線、加大葉片用量、選擇更濃綠的葉片等方式來解決色素量稍低的問題。

需要說明的是,所用材料差異、實驗操作、儀器設備以及公式本身都存在一定誤差,高中生在實驗操作中這些誤差可能更大,此外“適量”無水碳酸鈉的量也并不好把握。因此,為獲取更好的提取效果,建議采用無水乙醇作為提取劑。