血清FGL1、LncSChLAP1對晚期非小細胞肺癌免疫治療效果及預后評估的價值

夏寧,周澤軍,方申存,王尊喬,潘宴青

肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因,非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌的85%[1]。NSCLC起病隱匿,許多患者確診時已為晚期。晚期NSCLC的治療包括化療、分子靶向治療及免疫治療等,特別是免疫治療是近年來晚期NSCLC的重要治療進展[2-3]。纖維蛋白樣因子1(fibrinogen like protein 1,FGL1) 是纖維蛋白原家族成員,具有促進細胞增殖和代謝的生物學作用[4]。研究證實,FGL1是淋巴細胞活化基因3的一種新出現的檢查點配體,以FGL1為靶點的免疫治療是下一代免疫檢查點抑制劑研發的方向[5]。長鏈非編碼RNA SChLAP1(long non-coding RNA SChLAP1, LncSChLAP1)編碼基因位于2q31.3。研究報道,LncSChLAP1在前列腺癌、膀胱癌等惡性腫瘤中表達升高,介導腫瘤細胞的惡性增殖、轉移及耐藥性形成[6-7]。為此,本研究通過檢測接受免疫治療的晚期NSCLC患者血清FGL1、LncSChLAP1水平,分析兩者對治療療效及預后的評估價值,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年4月—2022年12月南京市胸科醫院呼吸內科診治晚期NSCLC患者98例為NSCLC組,男62例,女36例,年齡34～81(65.24±7.29)歲,有吸煙史35例;病理類型:肺腺癌60例,肺鱗癌38例;TNM分期:Ⅲb期58例,Ⅳ期40例;腫瘤分化程度:高分化30例,中分化44例,低分化24例;免疫治療線數:一線52例,二線30例,三線及以上16例。選取醫院同期健康體檢者50例作為健康對照組,男30例,女20例,年齡32～79(64.97±8.06)歲;有吸煙史15例。2組入選者性別、年齡及吸煙史比較,差異無統計學意義(P均>0.05),具有可比性。本研究已經獲得醫院倫理委員會批準(2023-KL003-01),受試者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:①年齡大于18歲;②經病理組織學確診為晚期NSCLC患者,TNM分期為Ⅲb～Ⅳ期;③美國東部腫瘤協作組體能狀態評分介于0～2分;④臨床資料完整;⑤有CT或MR可測量的病灶。(2)排除標準:①合并其他惡性腫瘤;②不能耐受免疫治療;③合并嚴重肝腎疾病或自身免疫性疾病;④合并驅動基因突變者,包括表皮生長因子受體基因、間變性淋巴瘤激酶基因及C-ROS原癌基因1等。

1.3 治療方法 晚期NSCLC患者均接受化療聯合程序性死亡因子1(programmed death-1,PD-1)單抗治療。化療:采用順鉑或卡鉑聯合白蛋白紫杉醇或培美曲塞二鈉化療。(1)培美曲塞二鈉+鉑類:每個治療周期第1 d,給予順鉑或卡鉑75 mg/m2,培美曲塞二鈉500 mg/m2,21 d為1個治療周期;(2)白蛋白紫杉醇+鉑類:每個治療周期第1 d,給予白蛋白紫杉醇175 mg/m2,順鉑或卡鉑75 mg/m2, 21 d為1個周期。共化療4個周期后評估療效。PD-1單抗選用納武單抗3 mg/kg,14 d為1個周期;派姆單抗2 mg/kg,21 d為1個周期,至少接受2個周期PD-1單抗治療。

1.4 檢測指標與方法

1.4.1 血清FGL1、LncSChLAP1檢測:患者于入院后次日清晨、健康對照組體檢日采取空腹肘靜脈血5 ml,室溫靜置1 h后,離心留取上層血清,將血清分為2份,一份采用酶聯免疫吸附實驗檢測血清FGL1水平,另一份采用實時熒光定量PCR檢測血清LncSChLAP1水平。酶聯免疫吸附實驗步驟按照人FGL1 ELISA試劑盒說明書(購自上海江萊生物科技公司,貨號JL47875-96T)進行,終止反應后酶標儀(購自美國伯樂公司,型號imark168130)檢測450 nm處的吸光度值,根據標準曲線計算樣品的FGL1濃度值;采用TRIzol 法提取血清總RNA,將血清總RNA逆轉錄為cDNA后,進行后續實時熒光定量PCR反應(ABI 7500實時熒光定量檢測系統購自美國ABI公司),SYBR GREEN MIX試劑購自北京素來寶神五谷科技公司,貨號SR1110。引物由上海生工生物公司設計合成。引物序列:LncSChLAP1上游:3’-CATATAACCCCGTCAACGCAG-5’,下游:3’- GCAGCCGCCACAAACATAC- 5’,GAPDH上游:3’-CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG- 5’, 下游:3’-CCAGCCCATGATGGTTCTGAT- 5’。反應體系:cDNA 1 μl,上下游引物各1 μl,SYBR GREEN MIX 10 μl,DEPC水7 μl。反應程序:預變性94℃5 min、94℃ 30 s,60 ℃退火 30 s,70℃延伸10 s,共40個循環。以2-△△CT法表示LncSChLAP1的相對表達量。以NSCLC組患者血清FGL1、LncSChLAP1的平均值48.68 μg/L、2.47為臨界值,分為FGL1高表達亞組(≥48.68 μg/L,n=48)和低表達亞組(<48.68 μg/L,n=50),LncSChLAP1高表達亞組(≥2.47,n=47)和低表達亞組(<2.47,n=51)。

1.4.2 隨訪:晚期NSCLC患者治療結束后采用電話和門診結合的方式定期回訪,每月隨訪1次,連續隨訪1年。隨訪內容包括有無腫瘤復發轉移,死亡及死亡原因等。隨訪終止時間為2023年1月。隨訪終點為隨訪時間結束或患者發生腫瘤相關死亡。

1.5 療效評價 治療前及治療結束后行胸CT檢查,參考實體瘤療效評價標準1.1評估療效[8]:完全緩解(CR):所有靶病灶消失;部分緩解(PR):所有靶病灶直徑的總和與基線相比至少減少30%;疾病進展(PD):與基線靶病灶直徑和最小值相比,所有靶病灶直徑的總和至少增加20%或出現新病灶;疾病穩定(SD):與靶病灶直徑和最小值相比,既達不到部分緩解標準、也達不到疾病進展標準。將CR+PR+SD者分為有效亞組(n=74),PD者分為無效亞組(n=24)。

1.6 統計學方法 利用SPSS 24.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示,2組間比較采用獨立樣本t檢驗;計數資料以頻數/率(%)表示,組間比較采用卡方檢驗;多因素Logistic回歸模型分析影響晚期NSCLC患者免疫治療療效的因素;受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve, ROC)分析血清FGL1、LncSChLAP1水平對免疫治療療效的評估價值;Kaplan-Meier曲線(Log-Rank檢驗)比較不同FGL1、LncSChLAP1水平對晚期NSCLC患者預后的影響。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 2組血清FGL1、LncSChLAP1比較 NSCLC組血清FGL1、LncSChLAP1水平分別為(48.68±6.65)μg/L、(2.47±0.36),高于健康對照組的(9.15±2.01)μg/L、(0.94±0.17),差異具有統計學意義(t=57.365、28.443,P均<0.001)。

2.2 2亞組患者臨床資料比較 晚期NSCLC患者免疫治療后,CR者0例,PR者34例,SD者40例,PD者24例。無效亞組TNM分期Ⅳ期比例、血清FGL1、LncSChLAP1水平高于有效亞組,差異具有統計學意義(P均<0.01)。2亞組患者的性別、年齡、吸煙史、病理類型、腫瘤分化程度、免疫治療線數比較,差異均無統計學意義(P>0.05),見表1。

表1 無效亞組、有效亞組患者在臨床/病理特征中的差異比較

2.3 多因素Logistic回歸分析影響晚期NSCLC患者免疫治療療效的因素 以晚期NSCLC患者的免疫治療療效為因變量(1=無效,0=有效),以血清FGL1(原值錄入)、LncSChLAP1(原值錄入)水平為自變量,以TNM分期(1=Ⅳ期,0=Ⅲb期)為協變量,多因素Logistic回歸分析結果顯示,血清FGL1、LncSChLAP1升高是影響晚期NSCLC患者免疫治療療效的獨立危險因素(P<0.01),見表2。

表2 影響晚期NSCLC患者免疫治療療效因素的多因素Logistic回歸分析

2.4 血清FGL1、LncSChLAP1及兩項聯合預測晚期NSCLC患者免疫治療療效的價值 繪制血清FGL1、LncSChLAP1及兩項聯合預測晚期NSCLC患者免疫治療療效的ROC曲線,并計算曲線下面積(AUC),結果顯示:血清FGL1、LncSChLAP1及兩項聯合的AUC分別為0.856、0.792、0.905,兩者聯合優于各自單獨預測效能,差異具有統計學意義(Z/P=4.258/0.007、5.119/<0.001),見表3、圖1。

圖1 血清FGL1、LncSChLAP1預測晚期NSCLC患者免疫治療療效的價值ROC曲線Fig.1 Serum FGL1, LncSChLAP1 value ROC curves for predicting immunotherapy efficacy in patients with advanced NSCLC

表3 血清FGL1、LncSChLAP1及兩項聯合對晚期NSCLC患者免疫治療療效的預測價值

2.5 血清FGL1、LncSChLAP1對晚期NSCLC患者生存預后的影響 98例晚期NSCLC患者隨訪中死亡57例,無失訪,1年總體生存率為41.84%(41/98)。FGL1高、低表達組1年總體生存率分別為22.92%(11/48)、60.00%(30/50)。LncSChLAP1高、低表達組1年總體生存率分別為27.66%(13/47)、54.90%(28/51)。FGL1高表達組、LncSChLAP1高表達組晚期NSCLC患者1年累積生存率分別低于FGL1低表達組、LncSChLAP1低表達組,差異均有統計學意義(χ2/P=14.180/<0.001、17.553/<0.001),見圖2。

圖2 血清FGL1、LncSChLAP1對晚期NSCLC患者生存預后的影響Fig.2 Effect of serum FGL1, LncSChLAP1 on survival prognosis of patients with advanced NSCLC

3 討 論

晚期NSCLC的治療方式包括放化療、靶向治療及免疫治療等。酪氨酸激酶抑制劑等分子靶向治療延長了驅動基因突變的晚期NSCLC患者的生存期,但對于多數驅動基因突變陰性或攜帶少見突變的晚期NSCLC患者靶向治療獲益有限[9]。近年來以免疫檢查點抑制劑為代表的免疫治療為驅動基因陰性的晚期NSCLC患者帶來了機遇和挑戰。腫瘤組織中PD-1或PD-L1的表達可作為免疫治療療效的評估指標,但受癌細胞異質性、動態進化性及組織取樣等的限制,其并不能準確預測免疫治療的療效[10]。因此,尋找能夠預測免疫治療療效的標志物,對于鎖定免疫治療獲益最佳的人群,降低免疫相關不良反應的發生,具有重要臨床意義。

FGL1編碼基因位于人染色體8p22區域,屬于纖維蛋白原家族成員,在肝臟損傷后分泌增多,參與促進肝細胞有絲分裂再生及新陳代謝等過程。近年來發現,FGL1在腎癌、胃癌等惡性腫瘤中表達升高[11-12],能促進腫瘤細胞增殖、轉移及免疫逃逸,導致腫瘤的進展。本研究中,晚期NSCLC患者血清FGL1升高,提示FGL1與NSCLC的腫瘤發生有關。NSCLC中FGL1的表達升高與轉錄調控異常有關。研究表明,肺腺癌中轉錄因子YY1能夠結合FGL1啟動子區域,促進FGL1的表達,進而導致腫瘤細胞的過度增殖[13]。另外,FGL1還能誘導肺腫瘤細胞上皮間質轉化及腫瘤血管生成,增強腫瘤細胞的侵襲和轉移能力[14]。本研究表明,無效亞組血清FGL1水平較高,提示血清FGL1水平有助于評估免疫治療的療效。分析其原因,PD-1單抗治療的機制是通過阻斷PD-1/PD-L1通路,恢復CD8+T淋巴細胞的正常免疫功能,但CD8+T淋巴細胞表面尚存在如FGL1、TIGIT等其他共抑制分子的配體。研究表明,對于FGL1表達升高的晚期NSCLC患者,FGL1能夠結合CD8+T淋巴細胞表面的LAG3配體,抑制CD8+T淋巴細胞的腫瘤殺傷效應,導致腫瘤免疫逃逸[4]。因此,血清FGL1水平升高的晚期NSCLC患者對以PD-1為靶點的免疫抑制劑治療療效較差,對于指導臨床醫生治療方案具有重要意義。有學者研究發現,以PD-L1和FGL1為雙靶向免疫治療能夠增加腫瘤微環境中CD4+和CD8+T淋巴細胞的浸潤,增強機體抗腫瘤的免疫功能[15]。本研究中,血清FGL1高表達的晚期NSCLC患者生存預后較差,提示血清FGL1是新的評估晚期NSCLC患者預后的腫瘤標志物。分析原因,一方面是FGL1的表達上調增強肺腫瘤細胞的增殖及侵襲能力,腫瘤惡性程度高,疾病進展快,導致患者不良預后。另一方面,FGL1還能促進腫瘤細胞上皮間質轉化形成,抑制腫瘤細胞凋亡,促進腫瘤細胞對吉非替尼等靶向藥物治療的耐藥性形成,導致患者不良預后[16]。

LncSChLAP1是一種長鏈非編碼RNA,參與染色質重塑和核小體修飾、mRNA的選擇性剪接及轉錄激活等多種生物學過程[17]。研究表明,前列腺癌中LncSChLAP1通過與果蠅zeste基因增強子同源物2相互作用,促進組蛋白H2K27甲基化修飾,促進前列腺癌細胞的增殖、遷移[18]。本研究中,晚期NSCLC患者血清LncSChLAP1升高,提示LncSChLAP1可能參與NSCLC的腫瘤進展。研究表明,SChLAP1能與異質性胞核核糖核蛋白L結合,抑制肌動蛋白α4蛋白的蛋白酶體降解,激活核因子κB,促進腫瘤惡性增殖及轉移[19]。本研究中,免疫治療無效亞組血清SChLAP1水平較高,提示血清SChLAP1水平有助于評估晚期NSCLC患者免疫治療的療效。分析其機制,SChLAP1能夠直接與AU堿基富集元件RNA結合因子1相互作用,拮抗其與PD-L1 mRNA 3’非編碼區結合,增加PD-L1 mRNA的穩定性和表達,抑制CD8+T細胞的腫瘤殺傷功能,導致腫瘤免疫逃逸,另外,PD-L1的異常表達升高能夠誘導腫瘤特異性CD8+T淋巴細胞的凋亡及耗竭,免疫效應分子如干擾素γ、腫瘤壞死因子α等分泌水平下降,降低PD-1單抗治療的療效[20-22]。另外,SChLAP1的表達升高還能夠增加腫瘤基因組的不穩定性,增加腫瘤組織的異質性,進而降低化療及免疫治療的療效[23]。本研究中,血清SChLAP1高表達的晚期NSCLC患者生存預后較差,表明SChLAP1是新的評估晚期NSCLC患者預后的血清標志物。筆者分析,SChLAP1高表達的NSCLC腫瘤增殖及轉移能力強,對免疫治療、化療等治療敏感性較差,這些因素均會導致患者不良生存預后。

本研究中,血清FGL1、LncSChLAP1聯合判斷晚期NSCLC患者免疫治療療效的敏感度和特異度為0.913、0.750,提示FGL1、LncSChLAP1是新的評估NSCLC患者免疫治療療效的血清標志物。臨床醫生可根據血清FGL1、LncSChLAP1水平,篩選出對免疫治療敏感的晚期NSCLC患者進行治療,減少免疫治療的毒副作用,降低醫療成本,改善患者臨床預后。另外,本研究中無效亞組TNM分期Ⅳ期比例較高。筆者分析,較高的TNM分期提示晚期NSCLC患者腫瘤負荷大、腫瘤異質性較高,潛在的驅動基因比例增加,進而導致腫瘤對化療耐藥性形成,導致化療療效降低。

綜上所述, 晚期NSCLC患者血清FGL1、LncSChLAP1升高,是影響晚期NSCLC患者免疫治療療效的獨立危險因素,兩者聯合對晚期NSCLC患者免疫治療療效具有較高的預測價值。血清FGL1、LncSChLAP1高表達晚期NSCLC患者生存預后較差,有助于晚期NSCLC患者生存預后的評估。本研究的不足在于未能對不同免疫治療療效的晚期NSCLC患者腫瘤微環境的差異進行基礎研究,以FGL1、LncSChLAP1為靶點的臨床治療能否成為改善免疫治療療效的新的治療方案,值得今后深入研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

夏寧:設計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;周澤軍:進行統計學分析,分析試驗數據,論文撰寫;方申存:課題設計,論文修改;王尊喬:實施研究過程,分析試驗數據,資料搜集整理;潘宴青:提出研究思路,論文審核