基于指紋圖譜與化學計量學的藿香正氣軟膠囊質量控制方法研究△

馬宿杉，蘇建，李舒琪，蘇紫藤，王常順*，劉永利*

1.河北科技大學，河北 石家莊 050000；2.河北省藥品醫療器械檢驗研究院/河北省中藥質量評價與標準研究重點實驗室，河北 石家莊 050000；3.河北中醫學院，河北 石家莊 050000

藿香正氣軟膠囊源于宋代的《太平惠民和劑局方》，首先由宋代醫者制成散劑服用，后又將散劑制成了丸劑，其由蒼術、陳皮、厚樸（姜制）、白芷、茯苓、大腹皮、生半夏、甘草浸膏、廣藿香油和紫蘇葉油組成，具有解表化濕、理氣和中的功效[1-2]，用于外感風寒、內傷濕滯或夏傷暑濕所致的感冒[3]。中藥指紋圖譜是中藥譜效關系研究的基礎，能夠實現對中藥內在質量的綜合評價和整體物質的全面控制[4]。藿香正氣軟膠囊現行質量標準為《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版（一部）[1]，要求對蒼術、陳皮、厚樸、白芷、甘草和廣藿香進行薄層鑒別，對陳皮、厚樸進行含量測定。該方法質量控制項目較完善，但方法繁瑣。現有藿香正氣軟膠囊的研究主要集中在含量分析方面[5-8]，未見指紋圖譜相關研究報道。因此，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）對其中10 個指標成分進行含量測定，建立指紋圖譜，結合化學計量學方法進行全面分析，進一步解析藿香正氣軟膠囊的質量特性，為建立更加完善的質量控制方法提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Ultimate 3000 型高效液相色譜儀（美國Thermo公司）；XPE26 型、XS105DU 型分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Milli-Q 型超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

對照品甘草苷（批號：111610-201106，純度：93.7%）、柚皮蕓香苷（批號：112080-202201，純度：100.0%）、橙皮苷（批號：110721-201316，純度：95.3%）、新橙皮苷（批號：111857-201102，純度：99.6%）、和厚樸酚（批號：110730-201313，純度：99.1%）、厚樸酚（批號：110729-201714，純度：100.0%）、歐前胡素（批號：110826-201918，純度：99.0%）、異歐前胡素（批號：110827-202113，純度：100.0%）、蒼術素（批號：111924-201102，純度：99.5%）均購于中國食品藥品檢定研究院；對照品花椒毒酚（批號：2009-24-7，純度：98.0%）、白當歸素（批號：482-25-7，純度：98.0%）、水合氧化前胡素（批號：2643-85-8，純度：98.0%）、白當歸腦（批號：26091-79-2，純度：98.0%）、珊瑚菜素（批號：2543-94-4，純度：98.0%）均購于上海詩丹德標準技術服務有限公司；對照品花椒毒素（批號：DST210407-062，純度：98.0%）、佛手柑內酯（批號：DST210409-012，純度：98.0%）均購于成都德思特生物技術有限公司；色譜純乙腈[批號：F22M2A201，賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；其他試劑均為分析純；水為超純水。藿香正氣軟膠囊樣品共15 批，來自A 企業12 批（批號分別為22053111、20102211、21010911、22022811、21031611、20020411、20070111、21041611、20112111、22021711、20042211、22031912）、B企業3批（批號為2930160～2930162）。

2 方法與結果

2.1 指紋圖譜和含量測定條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0～15 min，10%～47%A；15～20 min，47%A；20～30 min，47%～60%A；30～40 min，60%A；40～41 min，60%～10%A；41～50 min，10%A）；流速為1.0 mL·min–1；檢測波長為254、283 nm；柱溫為30 ℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取各對照品適量，精密稱定，加甲醇制成甘草苷、柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、水合氧化前胡素、花椒毒素、白當歸腦、歐前胡素、和厚樸酚、珊瑚菜素、異歐前胡素、厚樸酚質量濃度為2、200、23、27、12、8、12、24、13、8、18、20 μg·mL–1的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品內容物約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理（功率：250 W，頻率：33 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 指紋圖譜

2.3.1 精密度試驗 取藿香正氣軟膠囊（批號：20042211），按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件，連續進樣6 次，以歐前胡素峰為參照峰（S 峰），共有峰與S 峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于1.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 取藿香正氣軟膠囊（批號：20042211），按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進樣測定，以歐前胡素峰為S峰，共有峰與S峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于1.0%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.3.3 重復性試驗 取藿香正氣軟膠囊（批號：20042211），按2.2.2 項下方法平行制備6 份供試品溶液，按2.1 項下色譜條件，以歐前胡素峰為S峰，共有峰與S 峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于1.0%，表明該方法重復性良好。

2.3.4 指紋圖譜的建立及相似度評價 取15 批（S1～S15）的樣品，分別按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件測定。將15 批樣品色譜圖導入“中藥指紋圖譜相似度評價系統”（2012版）中進行數據分析，將S1 供試品色譜圖作為參考圖譜，采用中位數法生成對比圖譜，時間窗寬度為0.1，多點校正后自動匹配生成供試品疊加圖譜與對照圖譜R（圖1）。通過對15 批樣品指紋圖譜進行分析發現，圖中有22 個峰為樣品溶液色譜圖的共有色譜峰，由于17 號峰與相鄰色譜峰分離較好、峰面積較大、tR較為穩定，因此選擇17號峰（歐前胡素峰）為參照峰（圖2）。15 批藿香正氣軟膠囊樣品的指紋圖譜相似度均大于0.8，表明其質量較為穩定，化學成分具有良好的一致性。

圖1 藿香正氣軟膠囊供試品疊加圖譜與對照圖譜R

圖2 藿香正氣軟膠囊特征圖譜

2.3.5 主要色譜峰的指認 根據供試品和混合對照品的tR和紫外光譜分析結果，共指認15 個特征指紋峰（圖2）。

2.4 多指標成分含量測定

2.4.1 線性關系考察 取各對照品適量，精密稱定，加甲醇制成甘草苷、柚皮蕓香苷、橙皮苷、水合氧化前胡素、白當歸腦、歐前胡素、和厚樸酚、珊瑚菜素、異歐前胡素、厚樸酚質量濃度分別為0.3、2.0、3.0、0.2、0.2、0.5、1.0、0.2、0.4、2.0 μg·mL–1的混合溶液，搖勻，稀釋6、15、30、60、150 倍，得系列混合對照品溶液，精密吸取上述系列混合對照品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣，記錄色譜圖（圖3）。以質量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，結果顯示，各組分線性關系良好（表1）。

表1 藿香正氣軟膠囊中10個成分線性關系考察結果

圖3 對照品和藿香正氣軟膠囊HPLC圖

2.4.2 精密度試驗 精密取同一混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件連續進樣6次，甘草苷、柚皮蕓香苷、橙皮苷、水合氧化前胡素、白當歸腦、歐前胡素、和厚樸酚、珊瑚菜素、異歐前胡素、厚樸酚峰面積的RSD 分別為0.50%、0.12%、0.20%、0.96%、0.41%、0.64%、1.03%、0.68%、0.63%、0.35%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 取同一供試品（批號：20042211）溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、12、24 h，按2.1 項下色譜條件測定，甘草苷、柚皮蕓香苷、橙皮苷、水合氧化前胡素、白當歸腦、歐前胡素、和厚樸酚、珊瑚菜素、異歐前胡素、厚樸酚峰面積的RSD 分別為0.89%、0.80%、1.50%、0.75%、0.29%、0.62%、1.87%、0.71%、0.23%、0.20%，表明供試品溶液24 h 內穩定性良好。

2.4.4 重復性試驗 采用同一批藿香正氣軟膠囊（批號：20042211），按2.2.2 項下方法配制6 個樣品，按2.1 項下色譜條件測定其中10 個成分的質量分數，甘草苷、柚皮蕓香苷、橙皮苷、水合氧化前胡素、白當歸腦、歐前胡素、和厚樸酚、珊瑚菜素、異歐前胡素、厚樸酚質量分數的RSD分別為0.62%、1.45%、0.60%、0.79%、1.76%、0.66%、1.46%、1.35%、1.81%、0.85%，表明方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 取同一批藿香正氣軟膠囊（批號：20042211）內容物6 份，每份0.1 g，精密稱定，分別加入對照品溶液，計算回收率，如表2所示，方法的重復性良好。

表2 藿香正氣軟膠囊中10個成分加樣回收率試驗結果

2.4.6 樣品含量測定 將15批樣品按2.2.2項下方法配制供試品溶液，按2.1 項下條件進樣，采用外標法測定10 個成分的質量分數（表3）。

表3 15批藿香正氣軟膠囊中10個成分的質量分數 mg·g–1

不同企業藿香正氣軟膠囊10 個成分質量分數的箱線圖（圖4）顯示，B 企業的甘草苷、和厚樸酚、厚樸酚質量分數比A 企業高，其余7 個成分A 企業普遍較高，進一步說明不同企業的不同制備工藝對藿香正氣軟膠囊中指標成分的含量有影響。

圖4 不同企業藿香正氣軟膠囊10個成分的質量分數的箱線圖（n=15）

2.5 化學模式識別

2.5.1 聚類分析 采用SPSS 26.0 軟件，以共有峰峰面積為變量，對15 批樣品進行聚類分析，結果見圖5。根據樹狀圖可以看出，15 批藿香正氣軟膠囊樣品被分為2 個類群。相同生產廠家的樣品聚為一類，說明同一企業不同批次的產品具有較高相似度，但不同企業的樣品存在差異。

圖5 15批藿香正氣軟膠囊的聚類分析

2.5.2 主成分分析 將15 批樣品的共有峰峰面積數據導入SPSS 26.0 軟件，判斷的依據是特征值與累積方差貢獻率，計算主成分的特征值與方差貢獻率，從而對主成分進行提取[9]。以特征值>1 為提取標準，可得前2 個主成分的特征值分別為6.336 和1.975，方差貢獻率分別為63.362%和19.750%，累積方差貢獻率為83.112%，可以反映藿香正氣軟膠囊的綜合質量，故選取前2 個主成分進行評價。同時，采用SIMCA 14.1 軟件以10 個成分的含量數據構建主成分分析模型（圖6），提取出2 個主成分的自變量擬合指數（R2X）為0.967，表明所建立的模型穩定性較高。

圖6 15批藿香正氣軟膠囊的主成分分析得分

2.5.3 正交偏最小二乘法-判別分析 采用SIMCA 14.1 分析軟件，以15 批樣品共有峰峰面積為變量，采用正交偏最小二乘法-判別分析對15 批樣品進行研究，得到了正交偏最小二乘法-判別分析模型（圖7）。與變量重要性投影（VIP）值相結合，篩選15 批樣品的主要共有峰。以VIP 值>1 為標準，篩選出6 個差異性標志物的色譜峰，分別為6 號峰（水合氧化前胡素）、18 號峰（和厚樸酚）、20 號峰（異歐前胡素）、19 號峰（珊瑚菜素）、21 號峰（厚樸酚）和1 號峰（甘草苷），上述成分對分類的影響較大（圖8）。

圖7 不同企業藿香正氣軟膠囊的正交偏最小二乘法-判別分析

圖8 15批藿香正氣軟膠囊10個共有峰的VIP值（±s,n=15）

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

在前期研究中，通過改變流動相系統（乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液等）、柱溫（28、30、32 ℃），對色譜條件進行考察，結果顯示，當流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（梯度洗脫）、柱溫為30 ℃、流速為1 mL·min–1時所得色譜圖的基線平穩、色譜峰的分離效果較好。分析《中國藥典》2020 年版中白芷、陳皮、厚樸、北蒼術、茅蒼術藥材含量測定項下要求發現，本研究中22 個成分的檢測波長有較大差異，因此選擇采用梯度波長（254、283 nm）整合不同tR最佳色譜信息，根據《中國藥典》2020 年版要求及前期實驗結果確定采用2.1 項下色譜條件。

3.2 耐用性考察

本研究考察了不同色譜柱[COSMOSIL 5 C18-MS-Ⅱ（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Capcell pak C18MG Ⅱ（250 mm×4.6 mm，5 μm）及SHIMADZU VP-ODSC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]、不同流速（0.9、1.0、1.1 mL·min–1）、不同柱溫（25、30、35 ℃）等對藿香正氣軟膠囊指紋圖譜和10 個成分含量測定結果的影響，發現色譜條件的變化對各成分含量測定結果影響不大，說明本方法具有較好的耐用性。

3.3 結果分析

采用中藥指紋圖譜技術建立了15 批藿香正氣軟膠囊的HPLC 指紋圖譜，并鑒定出22 個共有峰，通過與混合對照品色譜圖進行比對，指認出15 個共有成分。對15 批樣品進行相似度評價，結果表明，15批樣品與標準指紋圖譜相似度都在0.8 以上，說明了不同批樣品在化學組成上有很好的一致性。聚類分析結果顯示，15 批藿香正氣軟膠囊樣品可分為2類，相同生產企業的樣品分為一類，主成分分析結果與其一致。采用正交偏最小二乘法-判別分析篩選得到水合氧化前胡素、和厚樸酚、異歐前胡素、珊瑚菜素、厚樸酚和甘草苷6 個差異性成分，可作為評價不同批次藿香正氣軟膠囊的差異性標志物。

4 結論

本研究以15 批藿香正氣軟膠囊樣品為研究對象，建立指紋圖譜及多成分含量測定方法，該方法準確、簡便、重復性好，能夠表征藿香正氣軟膠囊的整體質量，可用于藿香正氣軟膠囊的質量控制。采用化學計量學方法對不同批次藿香正氣軟膠囊的質量進行分析，篩選出不同批次藿香正氣軟膠囊質量差異性標志成分，本研究結果可為藿香正氣軟膠囊的進一步研究提供參考。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。