蟾蜍油炮制工藝及質量評價方法研究△

牟麗燕，高萌，陸兔林，毛春芹，季德，蘇聯麟，郭志俊，高波，羅川，殷放宙*

1.南京中醫藥大學 藥學院，江蘇 南京 210000；2.江蘇省中藥炮制重點實驗室，江蘇 南京 210000；3.華潤三九現代中藥制藥有限公司，廣東 惠州 516000；4.安徽華潤金蟾藥業有限公司，安徽 淮北 235000

哈蟆油為蛙科動物中國林蛙雌蛙的輸卵管，1985 年被載入《中華人民共和國藥典》，目前已被廣泛地應用于藥品、保健品、食品等中。目前，哈蟆油存在著供不應求的情況，急需尋找代替哈蟆油的新藥源。現有研究表明，蟾蜍油來自中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizansCantor 雌蟾蜍的干燥輸卵管，其化學成分與藥理作用與哈蟆油較相似，兩者均含有蛋白質、氨基酸、脂肪酸、微量元素、磷脂、核苷等，僅在部分成分的含量上有所差異[1-4]，此外蟾蜍油與哈蟆油均具有抗疲勞、抗衰老、抗應激、免疫調節等多種藥理活性[3-5]。因此，有必要對蟾蜍油進行深入研究，以緩解哈蟆油資源短缺問題，還可以使蟾蜍資源得到充分利用。但目前缺乏蟾蜍油加工工藝及其質量評價的相關研究。在蟾蜍油加工過程中，干燥是重要環節，其對蟾蜍油藥效成分具有重要影響。中藥指紋圖譜具有特征性、整體性等特點，能較全面地反映中藥中化學成分的種類與含量，實現對中藥質量的全面表征。動物藥的主要成分為蛋白質、多肽及氨基酸，其水解產物主要為氨基酸[6]，某些動物藥發揮藥效的物質基礎與氨基酸有關[7-11]。結合文獻[1-2,4]及本課題組前期超高效液相色譜-四極桿串聯飛行時間質譜法（UHPLC-Q-TOFMS/MS）、氣相色譜-質譜法（GC-MS）研究結果表明，蟾蜍油中氨基酸類成分的含量較高。研究發現，異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸具有抗氧化和免疫調節作用[12-14]，與蟾蜍油藥理作用一致，推測其為蟾蜍油的活性成分。因此，本研究以氨基酸及浸出物為指標，對蟾蜍油干燥工藝進行考察，并采用高效液相色譜法（HPLC）建立了蟾蜍油的指紋圖譜，同時對其氨基酸的含量進行測定，可為蟾蜍油的加工炮制及質量評價提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2998 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；SQP 型十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius 公司）；DHG-9140A 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；FD-IA-50 型冷凍干燥機（上海利聞科學儀器有限公司）；DZF-6090X 型真空干燥箱（上海鰲珍儀器制造有限公司）；HH 型數顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇金城國勝實驗儀器廠）；KQ-500E型超聲清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

對照品異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸（批號分別為112D022、416B029、718C024、804B0210，翼飛雪生物科技有限公司，純度均≥99%）；乙腈為色譜級；水為超純水；其余試劑為分析級。

1 批蟾蜍油鮮品來自山東，15 批蟾蜍油干品分別來自山東（S1～S5）、江蘇（S6）、安徽（S7～S9）、河南（S10～S12）、黑龍江（S13～S15），所有樣品經南京中醫藥大學陸兔林教授鑒定為蟾蜍科動物中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizansCantor 雌蟾蜍的輸卵管。

2 方法與結果

2.1 蟾蜍油干燥工藝優化

取1 批蟾蜍油鮮品，以樣品干燥呈不規則塊狀或呈雞腸樣、表面黃白色至黃棕色、無光澤為標準，考察熱風干燥、自然陰干、冷凍干燥和真空干燥對蟾蜍油的影響，按干燥品計算氨基酸和浸出物含量，并以其為指標，采用全概率評分法優選最佳工藝。按公式（1）計算全概率評分（P）。

式中Xij表示第j個指標下的第i個測定值，Sj表示第j個指標下各次結果的和。

2.1.1 氨基酸含量的測定

2.1.1.1 色譜條件 Waters XBridge C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.1 mol·L–1乙酸鈉溶液（用乙酸調pH 至6.5，7∶93，A）、乙腈-水（4∶1，B）為流動相梯度洗脫（0～2 min，0～10%B；2～15 min，10%～25%B；15～20 min，25%～30%B；20～25 min，30%～100%B；25～30 min，100%B），檢測波長為254 nm，流速為1 mL·min–1，柱溫為43 ℃，進樣量為10 μL。

2.1.1.2 對照品溶液的制備 取異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸對照品適量，精密稱定，加入0.1 mol·L–1鹽酸制成質量濃度分別為0.618、0.737、0.499、0.860 mg·mL–1的混合對照品溶液。

2.1.1.3 供試品溶液的制備 取蟾蜍油粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置水解管中，加5 mol·L–1鹽酸5 mL，150 ℃水解1 h，放冷，移至蒸發皿中，用水10 mL 分次洗滌，洗液并入蒸發皿中，蒸干，殘渣加0.1 mol·L–1鹽酸溶解，移至10 mL 量瓶中，加0.1 mol·L–1鹽酸至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.1.1.4 溶液衍生化 分別精密量取對照品或供試品溶液各1 mL，置5 mL量瓶中，加0.1 mol·L–1異硫氰酸苯酯的乙腈溶液1 mL，1 mol·L–1三乙胺的乙腈溶液1 mL，搖勻；室溫放置1 h 后，加50%乙腈至刻度，搖勻，取1 mL，加正己烷1 mL，振搖，放置10 min，取下層溶液，過0.22 μm微孔濾膜。

2.1.1.5 線性關系考察 精密量取混合對照品溶液，用0.1 mol·L–1鹽酸稀釋，得到一系列質量濃度的混合對照品溶液，進樣測定。以峰面積為縱坐標（Y），對照品質量濃度為橫坐標（X）繪制標準曲線，得異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸的回歸方程分別為Y=1.22×107X–1.90×104（r=0.999 4）、Y=1.18×107X–3.49×104（r=0.999 4）、Y=1.02×107X–2.49×104（r=0.999 4）、Y=1.60×107X+7.55×104（r=0.999 5），表明異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸的質量濃度分別為0.077～0.309、0.092～0.368、0.062～0.250、0.108～0.430 mg·mL–1時與峰面積線性關系良好。

2.1.1.6 方法學考察 精密度試驗：取混合對照品溶液，連續進樣6 次，計算異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸峰面積的RSD 分別為0.69%、0.98%、0.79%、0.93%，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣分析，計算4 種氨基酸峰面積的RSD 分別為1.74%、2.46%、0.97%、2.25%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

重復性試驗：取同一批蟾蜍油樣品6 份，每份0.5 g，精密稱定，平行制備6 份供試品溶液，衍生化處理后進樣測定，計算4 種氨基酸含量的RSD 分別為2.82%、1.68%、1.87%、1.46%，表明該方法重復性良好。

加樣回收率試驗：取樣品粉末5份，每份0.25 g，精密稱定，分別加入等量的混合對照品溶液，制備供試品溶液，衍生化處理后進樣測定，結果4 種氨基酸平均加樣回收率分別為97.78%、103.27%、100.74%、97.95%，RSD 分別為2.17%、0.84%、2.05%、1.02%，表明該方法準確可行。混合對照品和樣品HPLC圖見圖1。

圖1 混合對照品和蟾蜍油樣品氨基酸測定HPLC圖

2.1.2 熱風干燥工藝

2.1.2.1 單因素試驗 取蟾蜍油鮮品單層放置，分別在30、40、50、60、80 ℃干燥12 h，考察加熱溫度對樣品的影響；取鮮品單層放置，分別在50 ℃加熱9、10、11、12、13 h，考察加熱時間對樣品的影響；取鮮品分別按1、2、3層放置，50 ℃干燥11 h，考察物料厚度對樣品的影響。觀察各樣本外觀性狀并測定水分、浸出物及氨基酸總量，計算P。結果顯示，加熱溫度、加熱時間均不影響蟾蜍油外觀性狀，當加熱溫度為30、40、50 ℃時，加熱時間為9、10、11 h 時P較高；隨物料厚度的增加，蟾蜍油黏結成塊，當物料厚度為3 層時，蟾蜍油含水量較高，P隨物料厚度的增加而逐漸降低，結果見圖2。

圖2 蟾蜍油熱風干燥P 結果

2.1.2.2 正交試驗 在單因素試驗優化條件的基礎上，設計L9（33）正交試驗。以氨基酸總量及浸出物含量為指標，結合外觀性狀及水分含量優選最佳工藝，正交試驗結果見表1。由極差分析結果可知，影響結果的因素依次為物料厚度>加熱時間>加熱溫度，方差分析結果顯示，三因素對試驗結果的影響差異無統計學意義。綜合直觀分析及極差分析可知，蟾蜍油熱風干燥最佳工藝為取單層蟾蜍油平鋪，設定加熱溫度50 ℃，干燥11 h。

表1 蟾蜍油熱風干燥正交試驗結果

2.1.3 其他干燥工藝 本研究分別對自然陰干、冷凍干燥及真空干燥工藝進行了考察。取蟾蜍油鮮品單層放置，置陰涼通風處晾干[（22±3）℃，相對濕度65%，5 d]，間隔翻動，考察自然陰干對樣品的影響；取蟾蜍油鮮品單層放置，采用真空干燥，分別在40 ℃干燥10 h、50 ℃干燥8 h、60 ℃干燥6 h、70 ℃干燥5 h，考察真空干燥對樣品的影響；取蟾蜍油鮮品單層放置，采用冷凍干燥，分別預凍5 h 干燥13 h、預凍4 h 干燥14 h、預凍3 h干燥15 h、預凍2 h干燥16 h，考察冷凍干燥對樣品的影響。觀察各樣本外觀性狀并測定浸出物及氨基酸總量，計算P。

比較確定的最佳熱風干燥工藝與其他工藝P。由表2 可知，不同干燥工藝結果相近，因企業具有熱風干燥設備且熱風干燥成本低、效率高，在工業生產中應用廣泛，因此確定取單層蟾蜍油平鋪，50 ℃熱風干燥11 h為最佳炮制工藝。

表2 蟾蜍油不同干燥工藝考察結果（n=3）

2.2 蟾蜍油HPLC指紋圖譜的建立

2.2.1 供試品溶液的制備 取蟾蜍油粉末（過三號篩）約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，稱質量，超聲處理30 min（250 W，20 kHz），放冷，稱質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，即得。

2.2.2 色譜條件 Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以水（A）-乙腈（B）為流動相梯度洗脫（0～5 min，15%～85%B；5～15 min，85%～90%B；15～20 min，90%～100%B；20～25 min，100%B；25～30 min，100%～15%B），檢測波長為210 nm，流速為1 mL·min–1，柱溫為25 ℃，進樣量為10 μL。

2.2.3 方法學考察 精密度試驗：取同一份供試品溶液，連續進樣6次，以7號峰為參照峰，結果各共有峰相對保留時間的RSD為0.03%～0.16%，相對峰面積的RSD 為0.45%～4.41%，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一份供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣分析，計算各共有峰相對保留時間的RSD為0.08%～0.41%，相對峰面積的RSD為2.52%～4.87%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

加樣回收率試驗：取同一批樣品6 份，制備供試品溶液并進樣分析，計算各共有峰相對保留時間的RSD 為0.08%～0.32%，相對峰面積的RSD 為0.42%～4.98%，表明該方法重復性良好。

2.2.4 蟾蜍油指紋圖譜的建立與相似度評價 取15批蟾蜍油粉末，制備供試品溶液，進樣檢測。將所得的色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012A 版），以S1 樣品的色譜圖為參考圖譜，以中位數法生成對照圖譜，時間窗寬度為0.1 min，采用多點校正，選擇分離度及峰形較好的7 個色譜峰作為共有峰，進行Mark峰匹配，生成疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜（R），結果見圖3。以7 號峰為參照峰，樣品指紋圖譜共有峰相對保留時間的RSD 為0.10%～0.48%，相對峰面積的RSD 為8.43%～25.59%。以S1 樣品圖譜為參照圖譜，對蟾蜍油的指紋圖譜進行相似度評價，結果顯示與對照指紋圖譜相比，S1、S2、S4、S5 相似度為0.999，S3、S10～S12 相似度為1.000，S6、S13、S14 相似度為0.995，S7～S9 相似度為0.997，S15 相似度為0.996，相似度均大于0.99，說明不同批次蟾蜍油的整體質量較為接近。

圖3 15批蟾蜍油樣品的HPLC指紋圖譜

2.2.5 聚類分析 采用IBM SPSS Statistics 26 軟件對指紋圖譜數據進行聚類分析，以7 個共有峰的相對峰面積為變量，采用組間聯接法，以歐氏距離為測度，對15 批蟾蜍油進行系統聚類分析，結果見圖4A。當歐氏距離為5 時，15 批樣品被聚為三大類：S1～S5、S7～S9 聚為一類，S10～S12 聚為一類，S6、S13～S15聚為一類。

圖4 15批蟾蜍油聚類分析樹狀圖及PCA圖

2.2.6 主成分分析（PCA）將15批蟾蜍油的7個共有峰峰面積導入IBM SPSS Statistics 26 軟件進行PCA，以特征值>1為標準，確定了2個主成分因子，主成分1 的特征值為5.626，方差貢獻率為80.368%；主成分2 的特征值為1.014，方差貢獻率為14.482%，兩者的累積方差貢獻率為94.850%，表明前2個主成分可以代表蟾蜍油指紋圖譜共有峰的大部分信息。主成分載荷矩陣結果顯示，主成分1主要反映了色譜峰1～2、4～7 的信息，主成分2 主要反映了色譜峰3 的信息。以前2 個主成分對15 批蟾蜍油進行綜合評價，以方差貢獻率為分配系數，計算各批次蟾蜍油的主成分得分及綜合得分。以綜合得分值的大小評價各產地蟾蜍油的質量，結果見表3。樣品S12、S11、S10 為綜合得分的前3 名，說明這3批樣品質量較好。將共有峰峰面積導入SIMCA 14.1軟件進行PCA，得到PCA散點圖，見圖4B，樣品按產地聚為3類。

表3 15批蟾蜍油主成分得分、綜合得分及排名

2.3 蟾蜍油氨基酸含量的測定

取15 批蟾蜍油粉末，按2.1.1.3 項下方法制備供試品溶液并經衍生化處理后進樣分析，不同批次蟾蜍油中各氨基酸含量存在差異，異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸質量分數分別為0.40%～0.57%、0.57%～0.78%、0.54%～0.75%、0.26%～0.86%，結果見表4。

表4 15批蟾蜍油氨基酸質量分數測定結果%

3 討論

氨基酸含量研究中分別對鹽酸濃度（4、5、6 mol·L–1）和水解時間（0.5、1.0、1.5 h）進行了考察，確定最佳樣品制備方法。指紋圖譜研究中分別對提取溶劑（石油醚、乙酸乙酯、甲醇）、提取時間（20、30、40 min）進行了考察，確定了最佳的樣品制備方法；考察供試品溶液在200～400 nm 吸收波長情況。結果表明，在210 nm 波長處色譜峰數量較多、基線較平穩；此外，還對甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液4 種流動相進行了考察。結果顯示，以乙腈-水為流動相時，各色譜峰的分離度較好，且基線平穩。

熱風干燥具有成本低、操作簡單等優點，在工業生產中廣泛應用。因此，本研究對熱風干燥展開了考察；真空干燥采用抽真空和加熱同時進行，可加快水分蒸發，縮短干燥時間；冷凍干燥能夠保持產品原有的色、香、味、形及營養成分；自然陰干是傳統干燥方式。本研究對熱風干燥、真空干燥、冷凍干燥、自然陰干進行了考察。真空干燥中考察了加熱溫度和加熱時間對蟾蜍油的作用效果，結果顯示真空干燥溫度和干燥時間不影響蟾蜍油外觀性狀且樣品干燥適度，50 ℃加熱8 h 時P最高，效果最好。冷凍干燥中考察了預凍時間和冷凍干燥時間對蟾蜍油的作用效果，結果顯示冷凍干燥后蟾蜍油顏色變白、質地酥脆，預凍時間和冷凍干燥時間對蟾蜍油影響差異無統計學意義。自然陰干不影響蟾蜍油的外觀性狀且樣品干燥適度。不同干燥工藝結果相近，因企業具有熱風干燥設備且熱風干燥成本低、效率高，因此，確定取單層蟾蜍油平鋪，50 ℃熱風干燥11 h 為最佳炮制工藝。各批樣本指紋圖譜相似度均在0.99 以上，說明不同批次蟾蜍油化學成分種類差異無統計學意義，但各共有峰相對峰面積的RSD 差異大，表明各共有峰所代表的化學成分含量存在一定差異。采用聚類分析及PCA 對不同產地樣品指紋圖譜數據進行分析。聚類分析結果顯示，樣品按產地聚為不同的類別，安徽與山東產地的聚為一類，江蘇與黑龍江產地的聚為一類，河南產地的單獨聚為一類。由于江蘇的樣本只有1 例，其聚類結果有待商榷，后期增加樣本量來確認此結果。PCA 結果顯示，不同產地蟾蜍油質量存在一定的差異性，樣品S12、S11、S10 質量較好，PCA 得分圖顯示，結果與聚類分析結果一致。氨基酸含量測定結果顯示，不同批次蟾蜍油中氨基酸含量存在差異，推測造成這種差異的原因可能與產地、生長年限及養殖方式有關。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。