白木香內生真菌的分離鑒定及誘導結香作用研究△

黃穎，何欣，李浩凌，孟慧，陳旭玉，魏建和，陳德力，王斌，楊云*

1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所 中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室/瀕危藥材繁育國家工程實驗室，北京 100193；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所 海南分所 海南省南藥資源保護與開發重點實驗室/國家中醫藥管理局沉香可持續利用重點研究室，海南 海口 570311

白木香Aquilaria sinensis(Lour.) Gilg 又稱土沉香、牙香樹，是瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬（Aquilaria）珍貴藥用植物，主要分布于海南、廣東、廣西等地[1]。白木香是國產藥用沉香的唯一基原植物，其木質部中所含黑色樹脂稱為沉香[2-3]。沉香具行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘功效，現代藥理學研究證明其具有鎮痛、鎮靜、抗菌、抗炎、改善心肌缺血、抗腫瘤等作用[4]。白木香不會在自然狀態下結香，只有樹木受到自然損傷或人為傷害后，才會在傷口處累積樹脂，經過數十年沉積才能形成沉香[5]。由于沉香資源再生困難且被過度開發，沉香屬和擬沉香屬的全部植物均被納入《瀕危野生動植物種國際貿易公約》（CITES）附錄Ⅱ[6]。沉香稀有且價格高昂，在市場上長期處于供不應求的狀態，故其結香技術被廣泛關注。本課題組在2010 年發明了通體結香技術：通過植物自身的蒸騰作用將安全的結香液輸送至植物各部位，促使整株白木香樹內部結香[7]。該技術突破了白木香樹規模化產沉香的技術瓶頸，但單株產量和品質有待進一步提升。

許多學者認為微生物在沉香形成過程中發揮著重要作用，已有文獻報道內生真菌能夠有效促進白木香結香。例如，Cui 等[8]證明野生沉香中分離出的Paraconiothyrium variabile可誘導白木香結香，結香品質與天然沉香相似；Chen 等[9]篩選出2株具有良好誘導效果的可可色二孢菌Lasiodiplodia theobromae，2 個月即可誘導白木香結香；Zhang等[10]發現，尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum可快速誘導生成優質沉香。然而，實際生產中仍以物理方法（如砍傷等）和化學誘導法為主，真菌結香方式并未廣泛應用。為了獲得能夠高效促進白木香產生優質沉香的菌株，本研究以經通體結香技術誘導的白木香為研究對象，對木質部結香部位附近的內生真菌進行分離和初步鑒定，并進一步研究這些真菌誘導白木香結香的效果，為應用真菌綜合開發沉香資源提供參考。

1 材料

1.1 樣品

白木香木質部樣品于2022 年5 月采自中國醫學科學院藥用植物研究所海南分所海口研發中心試驗田，樣品來源于3 年生白木香樹，經中國醫學科學院藥用植物研究所海南分所楊云研究員鑒定為白木香Aquilaria sinensis(Lour.) Gilg。憑證標本保存于中國醫學科學院藥用植物研究所海南分所海南省中藥材標本館。

1.2 儀器

SW-CJ-2D型超凈工作臺（上海滬凈醫療器械有限公司）；GR60DA 型全自動立式高壓滅菌鍋[致微（廈門）儀器有限公司]；SPX-70B 型生化培養箱（北京科偉永興儀器有限公司）；ZWY-2012C 型立式雙層恒溫搖床（常州易晨儀器制造有限公司）；Z216MK 型臺式小型高速冷凍離心機[賀默（上海）儀器科技有限公司]；ECLIPSE80i 型生物顯微鏡（日本尼康株式會社）；HH-6型電熱恒溫水浴鍋（江蘇科技儀器有限公司）；2695/2475 型高效液相色譜儀[沃特世科技（上海）有限公司]；AL104-IC 型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；SB25-12DTDN 型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DHG-9070A 型恒溫電熱鼓風干燥箱（上海恒科學儀器有限公司）。

1.3 試藥

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基（批號：HB0233，青島海博生物科技有限公司）；沉香四醇對照品（批號：111980-201904，純度：98.6%）、沉香對照藥材（批號：121222-201203）均購自中國食品藥品檢定研究院；真菌基因組DNA 提取試劑盒（美國Omega Biotek 公司）；2×Taq聚合酶鏈式反應（PCR）Mastermix[天根生化科技（北京）有限公司]；GF254薄層色譜板（批號：HX17444229，德國Merck公司）；色譜純乙腈、甲酸（賽默飛世爾科技中國有限公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 真菌的分離和鑒定

2.1.1 分離 以通體結香技術處理的白木香為實驗材料，取木質部樹脂部分和未結香部分，采用傳統組織分離法進行真菌分離。以75%乙醇和10%次氯酸鈉為消毒劑進行表面滅菌，用無菌水洗凈表面殘留消毒劑后以無菌濾紙吸干水分，用無菌手術刀將樹脂部分和未結香部分切成小塊，接種至含50 mg·L–1氨芐青霉素的PDA 培養基中，密封，28 ℃培養3～5 d，菌絲長出后采用菌絲尖端挑取法反復純化至得到單菌落。

2.1.2 鑒定

2.1.2.1 形態特征 將純化的菌株接種于PDA 平板上，28 ℃培養3～7 d，觀察菌落大小、顏色、菌絲長短、菌落邊緣形態等，進行初步形態學分類鑒定。

2.1.2.2 內轉錄間隔區（ITS）序列分析 使用真菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的總DNA。以通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴增真菌ITS片段。擴增體系為由模板（基因組DNA 20～50 ng·μL–1）2 μL、2×TaqPCR Mastermix 25 μL、引物（10 mol·L–1）各2 μL 和滅菌ddH2O 19 μL。擴增程序為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30 個循環，最后72 ℃延伸7 min。PCR 擴增產物送至上海生工生物有限公司測序，測序結果與美國國家生物技術信息中心（NCBI）核苷酸序列數據庫（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）進行比對，確定菌株的種屬分類。

2.2 接種與樣品前處理

純化后的真菌于PDA培養基中培養5 d，將菌塊接種至馬鈴薯葡萄糖水（PDB）培養基中，28 ℃、180 r·min–1培養7 d，以無菌紗布濾過得到濾液。選取3年生健康白木香，在離地30 cm 處由下至上每隔20 cm鉆1個孔，將濾液注入孔中，以無菌木條封口；注入PDB作為對照（PDB組）。每個處理重復3次。

白木香接種4 個月后剖去接種處樹皮與外層木質部，測量每個接種處樹脂的延伸長度，用鏟刀取下整塊樹脂部分，陰干。將未結香部分剔除，剩余樹脂部分打粉后過二號篩和三號篩，備用。

2.3 薄層鑒別

稱取混合均勻的沉香樣品粉末（過二號篩）0.5 g，乙醚30 mL提取，超聲振蕩1 h，濾過，蒸干濾液，殘渣加三氯甲烷2 mL 溶解，作為供試品溶液。另取沉香對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，在三氯甲烷-乙醚（10∶1）條件下展開，取出后晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。

2.4 浸出物含量測定

沉香粉碎樣品2 g，置100 mL 錐形瓶中，精密加入95%乙醇50 mL，密塞，稱定質量，靜置1 h。連接冷凝管，加熱回流1 h。取下錐形瓶，密塞，放冷至室溫，稱定質量，95%乙醇補足減失的質量。干燥濾器濾過，精密量取濾液25 mL，置干燥且恒重的蒸發皿中水浴蒸干，105 ℃干燥3 h，干燥器中冷卻30 min 后，迅速精密稱定質量，以干燥品計算供試品中醇溶性浸出物含量。每個樣品重復3次。

2.5 特征圖譜分析和沉香四醇含量測定

按照《中國藥典》2020 年版[2]方法進行特征圖譜分析和沉香四醇含量測定。

3 結果

3.1 內生真菌的分離與鑒定

從白木香中共分離得到48 株內生真菌，其中31株來自樹脂部分、17 株來自未結香部分。菌株形態特征和分子生物學初步鑒定結果見表1。部分菌株的菌落及顯微照片見圖1。

表1 白木香內生真菌的形態特征及分子生物學初步鑒定結果

48 株內生真菌分別為鐮刀菌17 株，占35.42%；可可色二孢菌12 株，占25.00%；木霉屬13 株，占27.08%；枝孢屬2 株，占4.17%；曲霉屬2 株，占4.17%；刺盤孢菌屬1 株，占2.08%；硬孔菌1 株，占2.08%。鐮刀菌是白木香的優勢真菌，木霉屬和可可色二孢菌次之。

3.2 真菌的結香效果

選取不同種屬的10 株內生真菌，經液體培養后濾過，取菌液進行野外結香試驗，4 個月后削去接種孔附近樹皮與外層木質部。如表2 所示，內生真菌促進白木香產生的樹脂與PDB 組比較，結香長度更長、樹脂顏色更深，說明真菌在誘導白木香結香方面具有一定效果。在接種孔附近，內生真菌處理組均觀察到褐色或棕黑色樹脂與黃白色木部相間的斑紋，并呈現出從接種孔向上、向下延伸結香的趨勢（圖2）。

圖2 不同內生真菌促進白木香結香4個月的效果

表2 不同內生真菌處理的沉香樣品信息

3.3 沉香的薄層色譜

內生真菌誘導所得樹脂粉末的薄層色譜鑒別結果見圖3。樣品T6、T7、T9 與《中國藥典》2020年版規定沉香藥材的熒光斑點基本一致，其他樣品與對照藥材比較，缺少部分熒光斑點。結果表明，刺盤孢菌屬、黑曲霉和漸進綠木霉處理得到的樹脂符合《中國藥典》2020 年版標準。

3.4 沉香的浸出物含量

內生真菌誘導所結沉香的浸出物質量分數見圖4，T1（5.76%）、T2（8.68%）、T3（11.76%）、T4（8.83%）、T5（7.79%）、T7（10.16%）、T9（11.40%）與PDB組（6.42%）比較差異有統計學意義（P<0.05），表明內生真菌在促進結香方面有明顯作用。其中，T3 誘導4 個月所結沉香的浸出物質量分數最高，T9 和T7 次之，三者浸出物質量分數均大于10%，符合《中國藥典》2020年版標準。

3.5 沉香四醇含量測定

內生真菌誘導所結沉香的沉香四醇質量分數見圖5，T2（0.036%）、T3（0.070%）、T4（0.142%）、T5（0.078%）、T6（0.168%）、T7（0.124%）、T8（0.160%）、T9（0.141%）、T10（0.356%）與PDB組（0.020%）比較差異有統計學意義（P<0.05），結果表明，內生真菌在促進沉香四醇積累方面發揮作用。其中，T10 的沉香四醇質量分數為PDB 組的17.8 倍，顯著高于對照組（P<0.000 1）。T4、T6、T7、T8、T9、T10的沉香四醇質量分數均大于0.1%，符合《中國藥典》2020年版標準。

圖5 內生真菌誘導所結沉香的沉香四醇質量分數（±s,n=3）

3.6 特征圖譜分析

內生真菌誘導所產沉香特征圖譜見圖6，T4、T6～T10 和對照藥材的特征圖譜均有6 個特征峰，與《中國藥典》2020年版沉香特征圖譜的6個特征峰相對應，符合《中國藥典》2020 年版標準。T1～T3、T5、PDB組與對照藥材比較，缺少部分特征峰。

圖6 內生真菌誘導所產沉香的特征圖譜

4 討論

白木香在自然條件下幾乎不產生沉香，受到傷害后形成沉香的過程也十分緩慢。為保證沉香的可持續供應，研究人員發明了物理傷害、化學誘導和真菌誘導等方法[11]，其中真菌誘導法因誘導時間短、效果好、安全環保受到持續關注。真菌誘導法多以白木香內生真菌為材料，在白木香莖部注入菌液或填入菌絲，內生真菌侵染木質部促進沉香形成。內生真菌在植物中普遍存在，在影響宿主次生代謝等方面發揮重要作用[12-13]。目前，在多種藥用植物中發現內生真菌可提高次生代謝物產量。孫思勝等[14]篩選出鐮孢屬真菌、擬莖點霉屬真菌Phomopsissp.、Pleosporalessp.等6 株真菌，可以在2 個月內誘導降香檀產生黃酮類化合物和醇溶性浸出物。曾旭等[15]發現，赤霉屬真菌誘導龍血樹產生的血竭與血竭對照藥材的指紋圖譜相似度可達0.990，并檢測出7,4′-二羥基黃酮、龍血素A、白藜蘆醇等特征性化學成分。Chen 等[16]發現，硬孔菌可有效促進白木香產生沉香，其誘導的沉香精油中倍半萜類化合物相對含量為22.76%。

本研究對白木香木質部內生真菌進行分離、鑒定，得到48 株菌落形態有差異的真菌，樹脂部分分離的菌株多于未結香部分，與王磊等[17]的研究結果相似。選取不同種屬的10 株內生真菌進行野外結香試驗，4 個月后采集樹脂部分，按《中國藥典》2020 年版沉香項下薄層鑒別、浸出物含量測定、沉香四醇含量測定和特征圖譜要求進行綜合分析，結果表明，真菌在結香過程中起到明顯的作用。其中，黑曲霉和漸進綠木霉能產生較高品質沉香，檢測結果均符合《中國藥典》2020 年版標準。王東光等[18]對20 株白木香內生真菌進行結香效果評價，發現其中7 株結香10 個月產沉香的浸出物含量符合《中國藥典》2020年版要求，本研究中部分菌株誘導4個月即可達要求。此外，本研究還發現，不同菌株誘導所得沉香的浸出物和沉香四醇含量、薄層色譜斑點和特征圖譜有差異。導致這一現象的原因可能是誘導時間短，部分菌株促進效果未能完全體現；也可能是不同真菌的誘導效果不同，推測不同菌株在白木香結香過程中所起的作用不同，作用機制存在差異。

沉香主要成分為倍半萜類和色酮類化合物。部分學者認為，內生真菌可調節沉香樹內茉莉酸、水楊酸等植物激素水平，誘導倍半萜合酶基因表達，從而促進倍半萜類和色酮類化合物合成[19-20]；也有學者認為，在真菌體內酶的作用下，白木香木質部中薄壁細胞貯存的淀粉粒轉化為可溶性糖，經一系列生物轉化，最終形成香脂，經多年沉積形成沉香[21]。黑曲霉是曲霉屬真菌中常見的絲狀真菌，可分泌纖維素酶、羥化酶和還原酶等多種酶，具有轉化倍半萜類、黃酮類等化合物的能力[22-24]。漸進綠木霉是木霉屬真菌，木霉是多種酶類的重要來源，具有誘導植物防御反應的能力[25]。黑曲霉及漸進綠木霉誘導沉香形成的機制可能與酶促進生物轉化或激發植物產生防御反應有關，還需進一步開展菌液代謝物成分、接種后白木香植物激素、酶類及沉香特征性成分的含量變化研究，以揭示真菌促進白木香產生沉香的作用機制。

本研究報道黑曲霉和漸進綠木霉可促進白木香在短時間內產生符合《中國藥典》2020 年版要求的沉香。在取樣后繼續觀察，發現接種孔洞附近沉香仍持續增多，有四周擴散的趨勢，可見黑曲霉和漸進綠木霉有持續生產沉香的潛力，具有良好的應用前景，為短時間內可持續生產沉香藥材提供菌種資源，有望在沉香生產上得到推廣應用。為保證實際生產的產量和品質，下一步可優化黑曲霉和漸進綠木霉的培養條件和接種方式，進行中試放大研究，為規模化應用提供支撐。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。