比較蛋白質(zhì)組學(xué)揭示茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的雷公藤甲素生物合成△

張逸風(fēng)，趙瑜君，蘇平，吳曉毅，夏夢(mèng)，高偉*，黃璐琦*

1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心 道地藥材品質(zhì)保障與資源持續(xù)利用全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700；2.首都醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069

雷公藤為衛(wèi)矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordiiHook.f.的全根或根的木質(zhì)部，具有祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛的功效。其主要活性成分雷公藤甲素具有顯著的抗腫瘤、抗炎、免疫抑制等藥理活性[1-2]，可用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肝癌、胰腺癌等[3]。然而，當(dāng)前雷公藤甲素的獲取仍主要依賴于從植物中直接提取分離，其在基原植物中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為0.000 1%[4]。隨著新藥開(kāi)發(fā)、基礎(chǔ)科研和臨床需求不斷增加，藥物基原植物和土地資源破壞日益加劇，急需尋求新的資源獲取途徑。

近年飛速發(fā)展的合成生物學(xué)為雷公藤甲素等中藥活性成分異源獲取帶來(lái)可能。Paddon 等[5]通過(guò)整合青蒿素生源途徑基因至大腸埃希菌底盤，使青蒿素前體青蒿酸產(chǎn)量達(dá)到25 g·L–1，并通過(guò)簡(jiǎn)單的化學(xué)反應(yīng)獲得青蒿素。Hong 等[6]解析了士的寧生物合成下游8 個(gè)關(guān)鍵酶參與的10 步生物合成途徑，實(shí)現(xiàn)了煙草從頭合成士的寧、馬錢子堿等活性成分。因此，異源合成首先需要解析完整的生物合成途徑。雷公藤甲素的生物合成首先經(jīng)過(guò)甲羥戊酸（MVA）和2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）途徑生成牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（GGPP），后經(jīng)柯巴基焦磷酸合酶TwTPS7(v2) 和次丹參酮二烯合酶TwTPS27(v2)生成二萜骨架次丹參酮二烯[7]，再由CYP82Ds、CYP71BEs 等進(jìn)行骨架修飾[8-9]。盡管近年來(lái)在雷公藤甲素生物合成途徑解析方面取得了較好的進(jìn)展，但其生源途徑仍未完全解析。

蛋白質(zhì)是基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和加工后的產(chǎn)物，其作為生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者能夠直接參與代謝過(guò)程。通過(guò)蛋白質(zhì)水平的研究能夠有效反映不同生理或病理狀態(tài)下蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，相較于研究基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)其具有更直接的優(yōu)勢(shì)。目前，植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要應(yīng)用于大豆、水稻、番茄等[10-11]，在藥用植物領(lǐng)域應(yīng)用較少。本研究應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探究雷公藤甲素生物合成關(guān)鍵酶，為中藥活性成分生源途徑解析研究提供參考。

1 材料

1.1 樣品

雷公藤懸浮細(xì)胞由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心實(shí)驗(yàn)室繼代保存。

1.2 菌株和載體

大腸埃希菌Escherichia coli Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞、pEASY?-Blunt Zero載體均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pENTR ?/SD/D-TOPO?Vector、pENTR?/D-TOPO? Vector 均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；pK7GWIWG2D質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 試藥

Murashige&Skoog（MS）基本培養(yǎng)基（美國(guó)PhytoTechnology Laboratories 公司）；激動(dòng)素（KT）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、吲哚-3-丁酸（IBA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、卡那霉素、壯觀霉素均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer（美 國(guó)New England Biolabs 公司）；KAPA SYBR?FAST Universal 2×qPCR Master Mix（美國(guó)KAPA Biosystems 公司）；瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、RNA 純化試劑盒、FastKing RT Kit（With gDNase）均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；E.Z.N.A Plasmid Maxi Kit、E.Z.N.A Plasmid Mini Kit 均購(gòu)自美國(guó)Omega 公司；Gateway?LR Clonase? Ⅱ Enzyme Mix（美國(guó)Invitrogen公司）；Eastep?Super 總RNA 提取試劑盒（上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司）；二奎啉甲酸（BCA）試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。

1.4 儀器

Veriti?型96 孔梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國(guó)Applied Biosystems 公司）；LightCycler 480 型熒光定量PCR 儀（瑞士Roche 公司）；ZHWY-200D型恒溫振蕩搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）；MM400 型混合型研磨儀（德國(guó)Retsch 公司）；DYY-6D 型核酸電泳儀（北京市六一儀器廠）；BGgdsAUTO520 型凝膠成像分析系統(tǒng)（香港基因有限公司）；AC2-4S1 型生物安全柜（新加坡ESCO 科技有限公司）；5810R型低溫冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；BT25S型十萬(wàn)分之一天平（德國(guó)賽多利斯公司）；S210 型pH 計(jì)（美國(guó)Mettler-Toledo 公司）；ACQUITY UPLC? Ⅰ-Class System 型超高效液相色譜（美國(guó)Waters 公司）；NanoDrop One 型核酸/蛋白質(zhì)分析儀、EASY-nLC1000 型高效液相色譜（美國(guó)Thermo Scientific公司）。

2 方法

2.1 雷公藤懸浮細(xì)胞誘導(dǎo)與取樣

雷公藤懸浮細(xì)胞繼代培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接入含0.5 mg·L–12,4-D+0.5 mg·L–1IBA+0.1 mg·L–1KT的MS液體培養(yǎng)基（pH 5.8），在120 r·min–1、25 ℃黑暗培養(yǎng)。于繼代培養(yǎng)12 d后，誘導(dǎo)組加入終濃度為50 μmol·L–1的MeJA，對(duì)照組加入等體積溶劑，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)。分別于處理后0、24、48、72、240、360 h 取樣，各樣品組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

2.2 雷公藤甲素測(cè)定

2.2.1 雷公藤甲素提取 雷公藤懸浮細(xì)胞新鮮樣品于液氮環(huán)境下充分粉碎，冷凍干燥36 h，精密稱定樣品干燥粉末50 mg，置于2 mL 離心管中，精密加入80%甲醇1 mL，在25 ℃超聲提取60 min，功率為100 W，頻率為40 kHz，樣品取出放冷至室溫。6000×g離心10 min，上清液過(guò)0.22 μm 聚四氟乙烯（PTFE）微孔濾膜，即得供試品溶液，使用超高效液相色譜法（UPLC）分析[7]。

2.2.2 UPLC檢測(cè)條件 使用ACQUITY UPLC? Ⅰ-Class System 連接光電二極管陣列檢測(cè)器（PDA）；ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，30%～35%B；5～8 min，35%B；8～15 min，35%～70%B；15～21 min，70%～90%B）；流速為0.4 mL·min–1，進(jìn)樣量為1 μL；柱溫為40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為200～500 nm。

2.3 代謝物分析

以Ultimate 3000 超高效液相色譜儀（含自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、在線真空脫氣機(jī)、低壓四元梯度泵、PDA 檢測(cè)器）和LTD Orbitrap velos pro 質(zhì)譜儀 [高分辨靜電場(chǎng)軌道肼質(zhì)譜，電噴霧離子源（ESI）] 進(jìn)行檢測(cè)。色譜條件：Agilent SB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，2.7 μm）；柱溫為30 ℃；樣品盤溫度為4 ℃；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～65 min，5%～100%B）；流速為0.3 mL·min–1；進(jìn)樣體積為5 μL。ESI 參數(shù)設(shè)定：正離子掃描模式；毛細(xì)管溫度為350 ℃；毛細(xì)管電壓為35 V；噴霧電壓為3.5 kV；鞘氣（N2）流速為40 psi（1 psi≈6.895 kPa）；輔助氣（N2）流速為10 psi。樣品一級(jí)質(zhì)譜在全掃描模式下進(jìn)行全掃描（分辨率為30 000，掃描范圍為m/z150～1500），數(shù)據(jù)采集和分析采用Xcalibur ? 2.2 軟件。使用Metaboanalyst 在線代謝組數(shù)據(jù)綜合分析平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理，經(jīng)過(guò)歸一化、去噪后，將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)矩陣。采用多元統(tǒng)計(jì)分析中的偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）對(duì)不同類型的樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。

2.4 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

2.4.1 蛋白質(zhì)的裂解和定量 取全部樣品，于液氮環(huán)境中研缽磨碎成粉末狀，加入5 倍體積的丙酮-三氯乙酸（9∶1），渦旋混勻，在–20 ℃靜置4 h；4 ℃、5000×g離心40 min，棄上清液；加入預(yù)冷的丙酮，洗滌3 次，通風(fēng)櫥中干燥沉淀；取干燥后的粉末，分別加入SDT 裂解液 [含2%十二烷基硫酸鈉、100 mmol·L–1二硫蘇糖醇（DTT）、100 mmol·L–1三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）、pH 7.6]500 μL，渦旋振蕩徹底重懸沉淀，在100 ℃沸水煮8 min；超聲破碎提取蛋白質(zhì)（功率為80 W，工作時(shí)間為10 s，間歇時(shí)間為15 s，共破碎10 次），在100 ℃煮15 min；13 000×g離心50 min，取上清液，BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)含量；分裝并于–80 ℃保存蛋白質(zhì)樣品。

2.4.2 蛋白質(zhì)過(guò)濾輔助樣品制備（FASP）酶解 每份樣品分別取200 μg，加入DTT（100 mmol·L–1），100 ℃沸水煮8 min，取出后冷卻；加入尿素緩沖液（含8 mol·L–1尿素、150 mmol·L–1Tris-HCl，pH 8.0）200 μL混勻，轉(zhuǎn)入30 kDa蛋白質(zhì)超濾管，5000×g離心20 min；加入緩沖液200 μL，13 000×g離心20 min，棄濾液；加入碘乙酸銨（50 mmol·L–1碘乙酸銨溶于前述緩沖液）100 μL，600 r·min–1振蕩1 min，黑暗條件下室溫孵育30 min，13 000×g離心15 min；加入尿素緩沖液100 μL，13 000×g離心15 min，重復(fù)2 次；加入碳酸氫銨水溶液100 μL，13 000×g離心10 min，重復(fù)2次；加入胰蛋白酶緩沖液（胰蛋白酶4 μg溶于碳酸氫銨水溶液40 μL）40 μL，600 r·min–1振蕩1 min，37 ℃孵育16～18 h。換新收集管，13 000×g離心10 min，收集濾液，C18-SD Extraction Disk Cartridge脫鹽處理，280 nm下測(cè)定吸光度（A）。

2.4.3 高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）分析 取酶解產(chǎn)物2 μg進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。采用納升流速HPLC 液相系統(tǒng)連接EASY-nLC1000 分離。色譜柱為Thermo EASY column SC200 RP-C18（100 mm×150 μm，1.8 μm），流動(dòng)相A 為0.1%甲酸-乙腈水溶液（含乙腈2%），流動(dòng)相B 為0.1%甲酸-乙腈水溶液（含乙腈84%）。Thermo EASY column SC001 traps（20 mm×150 μm，1.8 μm，RP-C18）上樣，經(jīng)色譜柱分離，流速為0.4 μL·min–1。梯度洗脫（0～100 min，0～45%B；100～108 min，45%～100%B；108～120 min，100%B）。酶解產(chǎn)物經(jīng)HPLC分離后，經(jīng)Q-Exactive 質(zhì)譜儀分析；120 min，正離子檢測(cè)，母離子掃描范圍為m/z300～1800，多肽和多肽碎片的m/z按每次全掃描后采集20 個(gè)碎片圖譜[MS2scan，高能碰撞解離（HCD）]，MS1 在m/z200 時(shí)分辨率為70 000；MS2 在m/z200 時(shí)分辨率為17 500。

2.4.4 Label-free 定量及數(shù)據(jù)分析 將原始文件導(dǎo)入Maxquant 1.3.0.5 軟件，輸入自建的雷公藤轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)P16208_382410.fasta，各數(shù)據(jù)庫(kù)合并后蛋白質(zhì)數(shù)目為382 410，進(jìn)行非標(biāo)定量分析（LFQ）。主要參數(shù)設(shè)置為主檢索ppm 6；丟失碎片2；MS/MS允許ppm 20；胰蛋白酶；固定修飾類型：脲甲基化；可變修飾：氧化反應(yīng)；乙?；?；反向誘導(dǎo)數(shù)據(jù)模式；肽段FDR 0.01；蛋白質(zhì)FDR 0.01。

2.5 生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)用于分析差異蛋白質(zhì)的功能及定位。蛋白質(zhì)序列經(jīng)過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)及雷公藤P16208_382410數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行初步分析?；虮倔w（GO）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.geneontology.org/page/go-database）和InterProScan數(shù)據(jù)庫(kù)用于進(jìn)一步的功能注釋。京都基因與基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.kegg.jp）用于標(biāo)注蛋白質(zhì)分布。

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）基因表達(dá)分析

取MeJA處理后0、24、48、72、240、360 h的樣品，RNA提取方法參照試劑盒說(shuō)明書，第一鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄參照FastKing RT Kit（With gDNase）說(shuō)明書。依據(jù)KAPA SYBR?FAST Universal 2×qPCR Master Mix，使用qRT-PCR 儀進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)體系包括2×Fast qPCR Master Mix 10 μL、10 μmol·L–1正向引物（F）0.4 μL、10 μmol·L–1反向引物（R）0.4 μL、cDNA 1.0 μL，無(wú)菌水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 3 min；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。以β-actin作為管家基因，采用2–ΔΔCt法分析結(jié)果。引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 MeJA處理后不同時(shí)間雷公藤細(xì)胞樣品qRT-PCR分析引物

2.7 基因的體內(nèi)功能研究

2.7.1 目的基因全長(zhǎng)的克隆 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)引物，cDNA 擴(kuò)增得到目的序列全長(zhǎng)，引物見(jiàn)表2，反應(yīng)體系為Phusion Mix（2×）25 μL、正向引物（10 μmol·L–1）2.5 μL，反向引物（10 μmol·L–1）2.5 μL，質(zhì)粒模板1 μL，加入無(wú)菌水至50 μL。使用Veriti? 96 孔PCR 儀進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?8 ℃30 s；98 ℃ 10 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 15 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。DNA 片段連接Blunt-zero 克隆載體，轉(zhuǎn)化E.coliTrans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)單克隆陽(yáng)性PCR及測(cè)序驗(yàn)證，獲得目的基因全長(zhǎng)。

表2 雷公藤細(xì)胞中目的基因克隆引物

2.7.2 干擾表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)相應(yīng)基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增400～500 bp特異性片段的引物，引物見(jiàn)表3。采用Gateway 方法構(gòu)建干擾表達(dá)載體，分為入門載體構(gòu)建和表達(dá)載體構(gòu)建。

入門載體構(gòu)建：PCR 擴(kuò)增目的片段，純化產(chǎn)物2 μL、pENTR ? SD/D-TOPO?vector 0.5 μL、salt solution 0.5 μL 混勻，22 ℃反應(yīng)2.5 h，轉(zhuǎn)化E.coli Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞，以帶卡那霉素抗性的固體平板篩選，單菌落使用M13 正、反向引物（表3）進(jìn)行陽(yáng)性克隆驗(yàn)證并測(cè)序，獲得帶有目的片段的入門載體。

表達(dá)載體構(gòu)建：入門載體300 ng、表達(dá)載體pK7GWIWG2D 300 ng、TE Buffer（pH 8.0）0.6 μL、Gateway?LR Clonase Enzyme Mix 1 μL 配制反應(yīng)體系，25 ℃反應(yīng)4 h，轉(zhuǎn)化E.coliTrans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞，以含100 mg·L–1壯觀霉素抗性的固體平板篩選后，單菌落使用pK7正向引物（表3）、相應(yīng)序列反向引物進(jìn)行陽(yáng)性克隆驗(yàn)證并測(cè)序，獲得帶有目的片段的干擾表達(dá)載體。使用Plasmid Maxi Kit（OMEGA）進(jìn)行高濃度的質(zhì)粒提取。

2.7.3 雷公藤懸浮細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化 雷公藤懸浮細(xì)胞200 mg 轉(zhuǎn)繼代到MS 固體培養(yǎng)基，25 ℃避光預(yù)培養(yǎng)7 d后使用基因槍分別將含有目的基因（TwTF1、TwTF2、CYP82AQ2、CYP71BE89和Tw2ODD）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化懸浮細(xì)胞[12]。轉(zhuǎn)化空載體pK7GWIWG2D 及未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的懸浮細(xì)胞（WT）作為對(duì)照組，每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)。

2.7.4 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化驗(yàn)證、基因表達(dá)分析及雷公藤甲素含量檢測(cè) 轉(zhuǎn)化細(xì)胞繼續(xù)暗培養(yǎng)1 周后，提取懸浮細(xì)胞樣品總RNA 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用Kanamycin 的正反引物（表3）進(jìn)行克隆，通過(guò)PCR擴(kuò)增后電泳檢測(cè)是否含有1397 bp卡那霉素片段，驗(yàn)證表達(dá)載體是否成功轉(zhuǎn)入懸浮細(xì)胞。檢測(cè)干擾基因表達(dá)水平，方法同2.6 項(xiàng)下。雷公藤甲素提取與檢測(cè)方法同2.2項(xiàng)下。

3 結(jié)果與分析

3.1 懸浮細(xì)胞響應(yīng)MeJA誘導(dǎo)積累雷公藤甲素

為了觀察MeJA 對(duì)植物懸浮細(xì)胞中雷公藤甲素積累的影響，使用50 μmol·L–1MeJA 處理后，檢測(cè)0～360 h樣品中雷公藤甲素含量，同時(shí)使用未處理的懸浮細(xì)胞作為對(duì)照組。在最初的48 h 內(nèi)，雷公藤甲素的含量幾乎沒(méi)有變化，對(duì)照組和MeJA 處理組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。誘導(dǎo)后48 h，雷公藤甲素含量逐漸增加，并且MeJA 處理組增加幅度更明顯，至240、360 h，MeJA 處理組較對(duì)照組雷公藤甲素含量分別提升了2.96、4.23 倍（圖1）。這進(jìn)一步證實(shí)了MeJA 能促進(jìn)雷公藤懸浮細(xì)胞中雷公藤甲素的生物合成。

圖1 MeJA誘導(dǎo)雷公藤懸浮細(xì)胞中雷公藤甲素質(zhì)量分?jǐn)?shù)積累曲線（±s,n=3）

3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)樣品篩選及數(shù)據(jù)分析

采用無(wú)標(biāo)記比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測(cè)雷公藤甲素相關(guān)的蛋白質(zhì)受MeJA 誘導(dǎo)后的變化情況。在對(duì)樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)組測(cè)序之前，采用高分辨率質(zhì)譜法檢測(cè)雷公藤懸浮細(xì)胞中的化學(xué)成分，并采用OPLSDA 對(duì)樣品的所有峰值進(jìn)行化學(xué)計(jì)量分析。經(jīng)MeJA處理48、240 h的6個(gè)樣品（分別標(biāo)記為MJ48-1～MJ48-3和MJ240-1～MJ240-3）差異最大。其中，69.9%的化學(xué)成分可用于明確區(qū)分2組樣品（圖2）。根據(jù)雷公藤甲素累積曲線和OPLS-DA 結(jié)果，選擇MJ48 組和MJ240組樣品進(jìn)行無(wú)標(biāo)記定量并比較差異蛋白質(zhì)。

圖2 MeJA誘導(dǎo)雷公藤懸浮細(xì)胞樣品OPLS-DA

3.3 比較蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)分析

蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)中MJ48 和MJ240 2 組分別檢測(cè)到15 812、15 698 個(gè)特異肽段，分別注釋到2608、2562 個(gè)蛋白質(zhì)（在線數(shù)據(jù)庫(kù)ID：IPX000154000）。其中，142 個(gè)蛋白質(zhì)為MJ48 特有，96 個(gè)蛋白質(zhì)為MJ240特有。在2組共有的2466個(gè)蛋白質(zhì)中，138個(gè)蛋白質(zhì)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ratio<0.5 或>2.0，P<0.05）。與MJ48相比，64個(gè)蛋白質(zhì)在誘導(dǎo)后240 h表現(xiàn)為豐度增加，74個(gè)蛋白質(zhì)表現(xiàn)為豐度降低（圖3）。

圖3 MeJA處理后不同時(shí)間的雷公藤細(xì)胞蛋白組數(shù)據(jù)及差異蛋白聚類分析

3.4 差異蛋白質(zhì)功能分析

對(duì)檢測(cè)到的376 個(gè)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行GO 功能分析，可依據(jù)生物過(guò)程（BP）、分子功能（MF）和細(xì)胞組分（CC）進(jìn)行分類。以GO2為分類標(biāo)準(zhǔn)，三大類又可進(jìn)一步分為13、5 和6 小類。在BP 的各項(xiàng)分布中，代謝過(guò)程和細(xì)胞過(guò)程占比較大，分別占總數(shù)的40%、29%和8%。MF 分類中占比依次為催化活動(dòng)（54%）、聯(lián)結(jié)（35%）和結(jié)構(gòu)分子活性（7%）。而在376 個(gè)差異蛋白質(zhì)中，141 個(gè)蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞（46%）、91 個(gè)蛋白定位于細(xì)胞器（30%）、36 個(gè)蛋白質(zhì)屬于高分子復(fù)合物（12%）。

對(duì)功能分類中不同表達(dá)模式的蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步分析。依據(jù)MJ48 和MJ240 蛋白質(zhì)豐度變化規(guī)律，以不同顏色表示不同表達(dá)模式蛋白質(zhì)，繪制蛋白質(zhì)表達(dá)模式圖，見(jiàn)圖4A。依據(jù)蛋白質(zhì)表達(dá)情況，分為蛋白質(zhì)豐度上調(diào)組、豐度下調(diào)組、僅MJ48表達(dá)組和僅MJ240表達(dá)組。以蛋白質(zhì)豐度表達(dá)模式繪制各功能占比，見(jiàn)圖4B。圖4B顯示，與雷公藤甲素生物合成相關(guān)的功能以蛋白質(zhì)豐度下調(diào)（紫色）和僅MJ48表達(dá)（藍(lán)色）標(biāo)注的蛋白質(zhì)數(shù)量占比較大，以代謝過(guò)程相關(guān)的蛋白質(zhì)為例，蛋白質(zhì)豐度下調(diào)或MJ48特有的蛋白質(zhì)數(shù)量占該功能蛋白質(zhì)總數(shù)的58%，后期需要重點(diǎn)關(guān)注。同時(shí)，差異蛋白質(zhì)參與催化活動(dòng)和代謝過(guò)程的蛋白質(zhì)數(shù)量較多，表明MJ48 和MJ240 2 組間可能存在不同的代謝活動(dòng)，從而影響代謝物的產(chǎn)生。

圖4 MeJA處理后不同時(shí)間的雷公藤細(xì)胞差異蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

3.5 差異蛋白質(zhì)的代謝途徑分析

KEGG通路分析結(jié)果表明，376個(gè)差異蛋白質(zhì)共參與118 個(gè)代謝途徑。圖4C 根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)量從高到低列舉了20 個(gè)與二萜生物合成途徑相關(guān)的初生及次生代謝途徑，涉及二萜、倍半萜、三萜以及萜類骨架生物合成通路。

萜類骨架生物合成途徑檢測(cè)到8 個(gè)萜類骨架蛋白質(zhì)，其中，植物1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶（DXS）和3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶（HMGR）僅出現(xiàn)在MJ48 組，2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸胱氨酰轉(zhuǎn)移酶（MCT）和牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶（GGPS）僅在MJ240 組。另外4 個(gè)蛋白質(zhì)4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸還原酶（HDR）、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶（HMGS）、4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸合酶（HDS）和1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸鹽還原異構(gòu)酶（DXR）出現(xiàn)在下調(diào)組，蛋白質(zhì)豐度分別降低至MJ48 的0.18、0.24、0.49、0.19倍。上述8 個(gè)萜類骨架蛋白質(zhì)均參與萜類生物合成上游MVA 或MEP 途徑，生成萜類中間體IPP 和DMAPP用于繼續(xù)萜類的下游生物合成途徑。

3.6 差異基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

為了驗(yàn)證蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的真實(shí)性，利用qRTPCR檢測(cè)了上述8種萜類骨架酶編碼基因在MeJA 誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。表達(dá)模式可分為2 類，表達(dá)上調(diào)和表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5）。大多數(shù)基因歸為上調(diào)組：TwDXR、TwDXS、TwHMGS、TwHDS、TwGGPS、TwHDR、TwMCT。其中，TwDXR、TwDXS、TwHMGS、TwHDS和TwGGPS在誘導(dǎo)后48 h 表達(dá)量出現(xiàn)單峰，TwHDR在誘導(dǎo)后24 h 出現(xiàn)單峰，TwMCT在24 和240 h 有2 個(gè)高峰。而TwHMGR表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Liu 等[13]經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TwHMGR的表達(dá)高峰出現(xiàn)在誘導(dǎo)后4 h，并且誘導(dǎo)后12 h 恢復(fù)至正常水平。這些結(jié)果與相應(yīng)的蛋白質(zhì)豐度高度一致，表明蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，有助于探索參與雷公藤甲素生物合成的潛在蛋白質(zhì)。

圖5 MeJA誘導(dǎo)的萜類骨架基因相對(duì)表達(dá)水平（±s,n=3）

本研究檢測(cè)到了8 個(gè)細(xì)胞色素P450（CYPs）、3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（TFs）和2-氧戊二酸依賴的雙加氧酶（2ODD），對(duì)其編碼基因受MeJA 誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，見(jiàn)圖6。依據(jù)MeJA 組和對(duì)照組表達(dá)量，表達(dá)模式分為3類。第1類7個(gè)基因MeJA誘導(dǎo)后表達(dá)量高于對(duì)照組，包括4 個(gè)CYPs（CYP82AQ2、CYP71BE89、TwCYP-3和TwCYP-4）、2個(gè)TFs（TwTF1和TwTF2）和Tw2ODD。第2 類MeJA 處理組表達(dá)量低于對(duì)照組，包含2個(gè)CYPs（TwCYP-5和TwCYP-6）、1 個(gè)TF（TwTF3）。剩下的2 個(gè)CYPs（TwCYP-1 和TwCYP-2）在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合前期生物信息學(xué)分析結(jié)果，認(rèn)為第1類基因?yàn)楹笃趯?shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究對(duì)象。以上20個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)在比較蛋白質(zhì)組中的信息見(jiàn)表4、表5。

圖6 MeJA誘導(dǎo)的基因相對(duì)表達(dá)水平（±s,n=3）

表4 MJ48和MJ240中均表達(dá)的蛋白質(zhì)信息

表5 僅MJ48或MJ240組中蛋白質(zhì)信息

3.7 候選基因植物體內(nèi)功能表征

為了研究基因功能，選擇了與雷公藤甲素生物合成二萜合酶基因TwTPS7v2、TwTPS9v2和TwTPS27v2表達(dá)模式（圖6C）一致的基因作為候選基因，均表現(xiàn)為MeJA 誘導(dǎo)早期基因表達(dá)上調(diào)[7]，通過(guò)植物體內(nèi)功能表征觀察其對(duì)雷公藤甲素生物合成的影響?？寺～@得了長(zhǎng)度為590 bp的TwTF1、1640 bp的TwTF2、1734 bp 的CYP82AQ2、1620 bp 的CYP71BE89和1255 bp 的Tw2ODD。使用Gateway 分別構(gòu)建含目的基因特異性片段TwTF1（460 bp）、TwTF2（477 bp）、CYP82AQ2（453 bp）、CYP71BE89（491 bp）、Tw2ODD（503 bp）的RNAi 載體，基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化雷公藤懸浮細(xì)胞。各轉(zhuǎn)化組樣品中均檢測(cè)到1397 bp的載體片段，而未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的對(duì)照組相應(yīng)位置無(wú)條帶（圖7A），驗(yàn)證了基因成功轉(zhuǎn)入到懸浮細(xì)胞中。

基因干擾后，CYP82AQ2-RNAi組、CYP71BE89-RNAi 組、Tw2ODD-RNAi 組基因表達(dá)量較WT 組和空載組有明顯抑制（P<0.05，P<0.01），抑制率分別為33.4%、28.5%和77.9%；TwTF1-RNAi 組、TwTF2-RNAi組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖7B。同時(shí)，各組基因干擾后雷公藤甲素的含量表現(xiàn)不同程度降低。WT 組、pK7GWIWG2D 組、TwTF1-RNAi 組、TwTF2-RNAi組、CYP82AQ2-RNAi組、CYP71BE89-RNAi和Tw2ODD-RNAi組雷公藤甲素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（42.3±2.9）、（38.6±1.9）、（32.9±3.1）、（37.5±12.8）、（24.8±4.3）、（32.1±1.4）、（12.1±3.0）μg·g–1。與WT 和pK7GWIWG2D 對(duì)照相比，CYP82AQ2-RNAi、CYP71BE89-RNAi和Tw2ODD-RNAi組中雷公藤甲素含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），抑制率分別為41.4%、24.1%和71.4%；TwTF1-RNAi 和TwTF2-RNAi 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖7C）。由此說(shuō)明，CYP82AQ2、CYP71BE89和Tw2ODD的 轉(zhuǎn)錄表達(dá) 下調(diào)，直接抑制了雷公藤甲素的積累，表明這3 條基因與雷公藤甲素生物合成具有直接相關(guān)性。

4 討論

雷公藤甲素是雷公藤的主要活性成分之一，其能夠與著色性干皮病B（XPB，一種TFIIH亞族）結(jié)合從而抑制ATPase的活性[14]，并促使RNAPⅡCDK7退化發(fā)揮抗腫瘤的作用[15]，隨著藥理作用的不斷發(fā)現(xiàn)而受到越來(lái)越多的關(guān)注[2]。針對(duì)雷公藤甲素生物合成途徑仍未知的問(wèn)題，本研究借助比較蛋白質(zhì)組學(xué)尋找雷公藤甲素生物合成相關(guān)的蛋白質(zhì)。

蛋白質(zhì)作為基因功能的執(zhí)行者，參與多種生命活動(dòng)，而單純從基因和mRNA層面無(wú)法解釋其復(fù)雜的翻譯后修飾、蛋白質(zhì)間相互作用等過(guò)程。因此直接從蛋白質(zhì)層面研究蛋白質(zhì)組學(xué)受到越來(lái)越多的關(guān)注。蛋白質(zhì)組的出現(xiàn)使研究轉(zhuǎn)向mRNA和蛋白質(zhì)豐度，研究不同的基因表達(dá)如何調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能[16]。由于需要一系列的過(guò)程產(chǎn)生和維持細(xì)胞功能，包括生成轉(zhuǎn)錄組、加工和降解mRNA、翻譯、定位、修飾和凋亡自身蛋白質(zhì)，可以用蛋白質(zhì)豐度反映這些過(guò)程的動(dòng)態(tài)平衡。蛋白質(zhì)組學(xué)為蛋白質(zhì)豐度的研究提供了可能，這種蛋白質(zhì)層面的研究可以說(shuō)明不同方面的基因表達(dá)如何調(diào)節(jié)細(xì)胞蛋白質(zhì)豐度。現(xiàn)有數(shù)據(jù)證實(shí)，mRNA生成之后的后轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白質(zhì)降解調(diào)節(jié)都是為了保證蛋白質(zhì)豐度的穩(wěn)定狀態(tài)[16]。本研究利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究重在找出有意義的差異蛋白質(zhì)，因而具有更好的可實(shí)現(xiàn)性。

MeJA是植物中的一種重要物質(zhì)，其可以擴(kuò)散到植物的其他部位，影響植物的系統(tǒng)信號(hào)傳導(dǎo)，激活參與次生代謝的基因表達(dá)，增加萜類、類黃酮和生物堿的含量[17]。Miller 等[18]使用MeJA 處理云杉并持續(xù)4 d 監(jiān)測(cè)萜類揮發(fā)物，發(fā)現(xiàn)萜類化合物在處理后45 h 顯著增加。本研究比較分析了MeJA 誘導(dǎo)48、240 h的雷公藤懸浮細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，結(jié)果表明MeJA可以促進(jìn)萜類化合物的積累和基因表達(dá)，并在MeJA 誘導(dǎo)下的雷公藤甲素積累曲線中得到了證實(shí)（圖1）。借助生物信息學(xué)，從376個(gè)差異蛋白質(zhì)中初步篩選出了20 個(gè)可能與雷公藤甲素生物合成有關(guān)的蛋白質(zhì)。進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析和植物細(xì)胞體內(nèi)RNAi 結(jié)果聚焦于3 個(gè)蛋白質(zhì)（1 個(gè)Tw2ODD 和2 個(gè)CYPs）?；虮磉_(dá)與雷公藤甲素在植物不同組織中的積累規(guī)律一致，也表明CYP71BE89、CYP82AQ2和Tw2ODD與雷公藤甲素生物合成的相關(guān)性。

CYP71BE89 屬于CYP71BE 亞家族，文獻(xiàn)報(bào)道雷公藤基因組中可能存在CYP71BE家族基因擴(kuò)張[9]，同時(shí)，CYP71BE85 和CYP71BE86 被報(bào)道參與同構(gòu)型松香烷型二萜雷公藤內(nèi)酯酮的生物合成。此外，該亞家族中部分CYP 的功能在其他物種已被鑒定。CYP71BE5 作為α-愈創(chuàng)木烯-2-氧化酶，能氧化α-愈創(chuàng)木烯（倍半萜烯烴）的C-2 位生成化合物 (–)-莎草奧酮[19]。CYP71BE52在丹參中催化鐵銹醇C-2α位氧化為鼠尾草酚[20]。CYP71BE54促進(jìn) (–)-脫氧鬼臼毒素的去甲基化，形成 (–)-4′-去甲基脫氧鬼臼毒素[21]。CYP82AQ2 比CYP82 家族中的其他蛋白質(zhì)更接近CYP82A 和CYP82D 亞家族，是CYP82AQ 亞家族中的第二個(gè)酶，有待進(jìn)一步的探究。而Tw2ODD是本課題組此前報(bào)道的赤霉素13 位氧化酶[22]，可催化活性赤霉素相互轉(zhuǎn)化，從蛋白質(zhì)互作和生理水平影響雷公藤甲素的生物合成。

因此，本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了受MeJA 誘導(dǎo)的雷公藤懸浮細(xì)胞中蛋白質(zhì)的變化情況，利用萜類骨架基因驗(yàn)證了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，并揭示了后期可用于進(jìn)一步基因功能表征的候選基因。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。