‘紅地球’葡萄VvARF18功能分析

袁苗，周娟，黨仕卓，湯學燊，張亞紅

‘紅地球’葡萄功能分析

袁苗，周娟，黨仕卓，湯學燊，張亞紅

寧夏大學葡萄酒與園藝學院，銀川 750021

【目的】生長素響應因子ARF是生長素信號轉導途徑中的重要調控因子，在植物生長發育和各類生理過程中發揮著重要作用。分析‘紅地球’葡萄啟動子、異源表達、內源激素含量及其對激素響應的表達，以探究在‘紅地球’葡萄生長素（IAA）信號轉導途徑及花芽分化進程中的作用機理。【方法】以設施‘紅地球’葡萄花芽為試驗材料，通過同源克隆獲得序列，利用在線數據庫PLACE分析啟動子的順式作用元件。以pCAMBIAI2300植物表達載體為基礎，通過雙酶切和同源重組法構建植物超表達載體pC2300-。采用電擊法將重組載體pC2300-轉化至根癌農桿菌GV3101菌株中，以本氏煙草葉片為外植體，通過農桿菌介導的愈傷組織轉化法轉入煙草中，經PCR檢測獲得陽性轉基因幼苗。利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）對轉煙草株系表達水平進行分析，篩選出高表達量的轉基因株系培養至T3代，并分別進行IAA和GA3處理，以分析的表達情況。通過酶聯免疫法測定轉基因煙草花芽和葉片中的IAA、GA、ABA、CTK含量。【結果】‘紅地球’葡萄位于第13條染色體，含有3個外顯子和2個內含子。啟動子區域存在多種光響應、植物激素響應和逆境響應的順式作用元件。表型分析發現，轉基因煙草的花芽分化進程快于野生型煙草。qRT-PCR結果顯示，在轉基因煙草花芽發育的4個時期中呈先上升后下降的表達趨勢，且S3時期表達量達到最高。轉基因煙草植株花芽和葉片中IAA、CTK、GA和ABA測定結果表明，轉基因煙草花芽和葉片中4種植物激素的含量均高于野生型植株，其中GA/IAA在轉基因煙草花芽發育的4個時期中變化趨勢與表達趨勢相一致。轉基因煙草植株經IAA和GA3處理后，的表達量隨IAA處理濃度的增高而降低，也隨GA3處理時間的延長而降低。【結論】葡萄負調控生長素參與植物花芽分化進程，可能與赤霉素信號轉導途徑中的關鍵因子相互作用協同調控植物花芽中的激素水平，對植物花芽分化具有促進作用。

‘紅地球’葡萄；；轉基因植株；花芽分化；植物激素

0 引言

【研究意義】葡萄（）是世界上廣泛栽培的經濟果樹之一。花芽分化是開花的先決條件，葡萄花芽分化的好壞直接影響葡萄的生長發育、成熟期以及產量和品質[1]。在設施葡萄栽培中，由于棚膜老化透光率低，光照不均勻形成的弱光環境以及葉幕遮光等因素造成葡萄受光不足，從而導致葡萄花芽發育不良，成花能力差，嚴重影響了設施葡萄經濟產量和產業發展[2-4]。因此，挖掘葡萄中與花芽分化相關的基因并研究其功能和作用機理，對解決花芽分化不良阻礙設施葡萄產業健康發展問題具有重要的理論意義和實際應用價值。【前人研究進展】花芽分化是葡萄生長發育過程中十分重要的階段，葡萄花芽分化可分為生理分化和形態分化兩個階段[5]。生理分化即成花誘導，葡萄芽生長點內部發生一系列生理變化，是決定芽未來發育性質的關鍵時期[1]；形態分化跨越兩個生長季，花序分化時間相對較長，在新梢生長的當年完成，是決定葡萄第2年有無花的關鍵階段；花器官分化，于翌春萌芽前后至開花前完成，分化集中且短，主要決定花的質量[6]。環境因素（光照、溫度、水分）、樹體營養（碳水化合物和礦質元素）、栽培技術和內源激素水平是影響葡萄花芽分化的主要因素[1,6]。生長素（auxin，IAA）是最先發現的植物內源生長調節物質，在胚胎形成，維管束分化、莖的伸長、根的生長、花芽分化以及形態建成等植物發育過程中發揮著重要調節作用[7-9]。生長素響應因子（auxin response factor，ARF）作為生長素信號轉導途徑中的重要作用元件，能夠特異地與生長素響應基因啟動子區域的生長素響應元件（auxin response element，AuxRE）“TGTCTC”結合，激活或抑制基因的表達，進而參與調控胚胎發生、葉片器官衰老、維管束形成、花和子葉發育等植物生長發育過程[10-12]。近年來，隨著基因組測序技術的快速發展，越來越多植物中的ARF家族成員被鑒定，在擬南芥（）[13]、煙草（）[14]、水稻（）[15]、大豆（）[16]、番茄（）[17]、黃瓜（）[18]、葡萄[19]、梨（）[20]等植物中分別鑒定出23、50、25、51、21、15、19和31個ARF家族成員。隨著對的深入研究，發現在植物花器官發育和花芽分化過程中扮演著重要角色。擬南芥參與花器官的發育[21-22]；和調控花器官成熟[23]；促進花藥及花粉管壁的形成[24]。番茄在花芽中的表達量最高，對花的發育具有促進作用[25]。ARF家族基因整體上在葡萄剛萌動的葉芽、休眠芽和果實中的表達量較高，在腋芽中表達量相對較低[26]；葡萄、和在果實發育過程中呈高水平表達，而在花中表達水平較高，表明可能參與調控葡萄花和果實的發育[19]；vvi-miR160c/d/e可能介導其靶基因在葡萄種子發育的特定階段調控種子的發育形成[27]。在番木瓜（）花芽分化進程中呈不斷上升的表達趨勢，推測可能參與番木瓜花芽的形成[28]。ARF不僅能與生長素響應基因特異結合引發生長素介導的多種生理效應，還能與其他植物激素相互作用影響植物生長發育[29]。在番茄坐果和發育過程中同時受生長素和赤霉素反應的調節作用[30]。【本研究切入點】筆者課題組前期對‘紅地球’葡萄花芽分化過程中4個發育階段的冬芽進行轉錄測序分析，通過KEGG富集分析發現差異表達基因在植物激素信號轉導通路中顯著富集，其中在葡萄冬芽發育的后3個階段高度表達，推測在葡萄花芽分化過程中可能起到重要的調控作用。目前，關于ARF家族基因的研究多集中在一些模式植物上，且對與植物激素在葡萄芽發育過程中的生物功能及調控機制的研究較少，在葡萄花芽分化過程中的分子機理尚不明確，是否參與了葡萄花芽分化及其調控方式有待研究。【擬解決的關鍵問題】本研究構建植物超表達載體，并獲得轉基因煙草材料，探究對煙草花芽發育的影響，為進一步開展參與葡萄花芽分化調控機理的研究提供參考。

1 材料與方法

試驗于2021—2022年在寧夏大學葡萄酒與園藝學院葡萄抗逆分子育種實驗室進行。

1.1 試驗材料

供試葡萄材料為10年生‘紅地球’葡萄（cv. Red Globe），栽培于銀川市賀蘭縣園藝產業園（106°16′ E，38°20′ N）15號陰陽結合型日光溫室。供試煙草材料在光照培養箱中培養，培養至4—6葉期備用。

試驗中所用的高保真酶、DNA Marker、限制性內切酶、無縫克隆試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、大腸桿菌（）DH5均購于北京天根生化科技有限公司；根癌農桿菌（）菌株GV3103和pCAMBIA2300植物表達載體均由寧夏大學葡萄抗逆分子育種實驗室保存；引物合成和測序均由上海生工生物工程有限公司完成；其余試劑均為國產或進口分析純。

1.2 生物信息學分析

筆者課題組前期通過同源克隆獲得葡萄序列[31]。運用在線網站Grape Genome Browser（https:// www.genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/）分析的染色體定位、內含子及外顯子區域。使用在線工具ExPASy ProtParam（https://web.expasy. org/protparam/）分析VvARF18蛋白的基本理化性質；利用在線數據庫PLACE（https://www.dna.affrc.go.jp/ PLACE/?action=newplace）預測ATG上游1 500 bp區域的啟動子順式作用元件。

1.3 VvARF18過表達載體的構建

根據的編碼序列（coding sequence，CDS）設計植物表達載體的特異性引物（表1）。以‘紅地球’葡萄花芽反轉錄的cDNA為模板，通過PCR擴增獲得目的片段。I和I雙酶切過表達載體pCAMBIAI2300后，將膠回收的目的片段與酶切后線性化載體通過同源重組的方法連接到一起，連接產物轉化至DH5感受態細胞，篩選陽性克隆，經測序驗證后得到pC2300-植物過表達載體。

1.4 轉基因本氏煙草株系的獲得及鑒定

pC2300-植物過表達載體通過電擊法轉化根癌農桿菌GV3101感受態，然后利用根癌農桿菌GV3101轉化煙草葉盤[32]，用50 mg·L-1的卡那霉素和潮霉素篩選出20個轉基因煙草株系，實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）鑒定出10個轉基因煙草株系并分析基因在轉基因陽性植株的相對表達量，確定過表達煙草株系。隨后對T1代種子進行分離，并在培養箱中繁殖出相應的T3代轉基因植株。

1.5 植物激素的測定

參考劉鑫等[33]的方法提取本氏煙草幼葉（莖2—3節）、嫩葉（莖6—7節）、老葉（莖10—12節）和花芽發育S1（0.5 cm）、S2（1 cm）、S3（1.5 cm）、S4（2 cm）4個時期中的植物激素，植物激素的測定使用酶聯免疫試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司），使用酶標儀（Labsystems Multiskan MS-352）測定生長素、赤霉素（gibberellin，GA）、細胞分裂素（cytokinin，CTK）、脫落酸（abscisic acid，ABA）含量[34]，試驗設置3次生物學重復。

1.6 VvARF18對生長素和赤霉素的響應

為進一步探究對生長素的響應，選取4—6周生長一致的轉基因本氏煙草，外源噴施IAA和GA3，處理方法參考LAKEHAL等[35]，配制1 mmol·L-1的IAA母液和GA3母液，在此基礎上分別稀釋至20、50和100 μmol·L-1濃度對轉基因煙草進行噴施處理，篩選出最佳濃度，分別處理1、3、5和8 h，每個處理3個重復，以外源噴施無菌水為對照（CK），將處理后的煙草采集統一位置葉片用錫紙包裹住，迅速用液氮冷凍，保存至超低溫冰箱。提取不同處理的煙草葉片總RNA，反轉錄合成cDNA后，參考袁苗等[31]反應體系和反應程序進行qRT-PCR，分析噴施不同濃度和不同處理時間下生長素和赤霉素對葡萄表達的影響。

1.7 數據處理和分析

使用Excel 2019整理數據，并采用IBM SPSS 25.0對試驗數據進行統計分析，利用單因素ANOVA檢驗和Student’s-test進行顯著性分析（＜0.05），然后使用Origin Pro 2021作圖。試驗數據以平均值±標準差（SD）表示，試驗設置3次生物學重復。

表1 引物列表

下劃線部分為限制性內切酶位點 The underlined sequences are the site of restriction endonuclease

2 結果

2.1 VvARF18的生物信息學分析

定位于第13條染色體，含有3個外顯子，2個內含子；VvARF18中丙氨酸占比最高，為6.9%，分子量約為74.82 kDa，理論等電點pI為6.43，不穩定指數為49.07，GRAVY（grand average of hydropathicity）值為-0.404，屬于酸性不穩定親水蛋白（圖1）。

2.2 VvARF18啟動子分析

選取上游1 500 bp區域的啟動子序列并利用PlantCARE在線軟件進行分析，該基因啟動子區域除TATA-box、CAAT-box等一些基本順式作用元件外，還存在光響應元件G-Box、G-box、AE-box、Box 4、TCCC-motif和GT1-motif；激素響應元件TGACG-motif、AuxRR-core、ABRE和P-box；同時還包含低溫響應的順式作用元件LTR和參與干旱脅迫的順式元件MBS（表2）。

2.3 VvARF18在煙草中的遺傳轉化和陽性鑒定

通過同源重組獲得pC2300-重組質粒（圖2-A）。對構建的pC2300-重組質粒進行PCR檢測，經檢測已正向插入pC2300表達載體中，過表達載體pC2300-構建成功（圖2-B）。進一步使用葉盤轉化法將pC2300-重組質粒轉化至煙草葉片中，通過抗性篩選后仍正常生長的煙草幼苗為陽性植株，說明已成功轉入煙草的基因組中（圖2-C）。

為進一步探究在轉基因煙草植株中的表達情況，采用qRT-PCR對轉基因煙草的表達量進行測定。10個轉基因煙草株系中的表達量存在差異，其中轉基因煙草株系OE#1、OE#2、OE#5、OE#7、OE#8、OE#10的表達量顯著高于野生型（CK）。此外，OE#1、OE#7和OE#8的表達量顯著高于其他轉基因株系（圖3），因此，挑選出OE#1、OE#7和OE#8轉基因煙草植株培養至T3代進行異源表達的功能分析。

2.4 轉基因煙草表型分析

通過對T3代轉基因煙草植株與野生型煙草植株的表型觀察發現，轉入葡萄的煙草能夠正常的生長發育及開花結果，進一步觀察本氏煙草花芽分化進程時發現，轉基因煙草的花芽分化進程要快于野生型煙草植株，說明轉基因煙草生殖生長階段快于野生型煙草，葡萄對花芽分化進程具有促進作用（圖4-A）。

2.5 轉基因煙草不同發育時期花芽中VvARF18的表達特性分析

為進一步研究在花芽分化進程中的功能，首先采集轉基因煙草植株不同發育時期的花芽（圖4-B），利用qRT-PCR對在轉基因煙草花芽發育4個時期的表達模式進行分析。結果顯示（圖4-C），在轉基因煙草花芽發育的4個時期中呈現出先上升后下降的表達趨勢，且在花芽發育的S3時期表達量最高，分別約為S1、S2、S4時期的2.8、2.4和6.1倍，表明可能參與植物花芽發育過程，對植物花芽分化具有促進作用。

2.6 轉基因煙草不同花芽發育時期中植物激素水平分析

轉基因煙草花芽中IAA、CTK、GA和ABA 4種植物激素的含量均高于野生型煙草（圖5），說明轉基因煙草植株中各植物激素代謝相對較旺盛，對植株的花芽分化具有良好的促進作用。GA和ABA在轉基因煙草4個發育時期的花芽中呈先上升后下降的變化趨勢，這與在轉基因煙草花芽發育4個時期中的表達趨勢類似，說明可能與GA和ABA協同參與植物花芽分化進程。IAA和CTK在轉基因煙草花芽發育的4個時期中變化趨勢與的表達趨勢均相反，呈現出先下降后上升的趨勢，表明可能負調控IAA參與植物花芽分化進程。

A：植物超表達載體pC2300-VvARF18構建過程示意圖。B：重組載體pC2300-VvARF18的菌液PCR檢測，M：DL4500 bp DNA marker；泳道1—3：pC2300-VvARF18菌液PCR檢測。C：農桿菌介導的煙草葉片組織培養，a：煙草葉片共培養；b：誘導轉基因煙草的愈傷組織；c：篩選的陽性植株；d：分化過程；e：生根培養的轉基因植株

OE#1—10表示轉基因植株的不同株系 OE#1-10 indicate different strains of transgenic plant。*: P＜0.05；**: P＜0.01

表2 VvARF18啟動子順式作用元件分析

WT：野生型煙草；OE：轉基因煙草。不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同

圖5 轉基因煙草不同發育時期花芽中激素含量

進一步分析發現在轉基因煙草4個發育時期的花芽中各植物激素比值的變化趨勢相差較大（圖6）。在野生型煙草花芽發育的4個時期中，CTK/IAA、ABA/GA和ABA/IAA均呈現出先下降后上升的變化趨勢；CTK/ IAA和ABA/IAA在轉基因煙草中呈先上升后下降的趨勢，ABA/GA呈上升趨勢，而GA/IAA的變化趨勢與在轉基因煙草花芽發育4個時期中表達趨勢相一致，表明作為生長素信號轉導途徑中起負調控作用的轉錄因子可能與赤霉素、細胞分裂素及脫落酸信號轉導途徑中的關鍵因子相互作用協同調控植物花芽中的激素水平，從而促進植物花芽分化的進程。

2.7 轉基因煙草不同葉片組織中植物激素水平分析

轉基因煙草植株的3種葉片組織中,IAA、CTK和ABA的含量均顯著高于野生型煙草，GA在野生型煙草幼葉中的含量顯著高于轉基因煙草，而在轉基因煙草嫩葉和老葉中的含量顯著高于野生型煙草（圖7），表明轉基因煙草植株中各內源激素在葉片組織中的代謝與積累水平相對較好，能夠促進植株功能葉片的良好發育。

2.8 外源IAA和GA處理對轉基因煙草中VvARF18表達的影響

ARF作為植物生長素響應的關鍵調節因子，在植物生長發育過程中可與下游目的基因特異性結合并調控其表達，從而引發IAA介導的諸多生理效應。圖8顯示，IAA處理后，轉基因煙草中的表達量總體呈現下降的趨勢，隨著噴施IAA濃度的增高，轉基因煙草中的表達量逐步降低（圖8-A）。20 μmol·L-1IAA處理后，轉基因煙草中呈先升高后下降的趨勢，的表達量在3 h達到最高，之后逐漸降低（圖8-B）。說明IAA水平能夠影響的表達，推測高水平IAA可能促進VvARF18蛋白的降解，植物體內ARF18蛋白的降解容易受IAA水平的影響，也說明在植物生長素信號轉導途徑中起負調控作用。生長素在生物合成水平上與GA存在相互作用[27]。GA3處理后，轉基因煙草中的表達量呈先下降后上升的變化趨勢，且在100 μmol·L-1GA3處理下的表達量達到峰值（圖8-C）。100 μmol·L-1GA3使轉基因煙草中呈下降表達趨勢，在1 h時表達量達到峰值（圖8-D）。

圖6 轉基因煙草不同發育時期花芽中激素含量的比值

圖7 轉基因煙草不同葉片組織中激素含量

圖8 VvARF18在外源IAA和 GA3處理下的表達

3 討論

3.1 VvARF18序列特征

ARF是生長素信號轉導途徑中的關鍵轉錄因子，能夠特異性結合生長素響應基因啟動子區域的AuxRE元件，調控生長素應答基因的表達，從而影響植物生長發育[25]。本研究發現VvARF18屬于植物特有的ARF家族蛋白成員，這與白云赫等[27]從‘魏可’葡萄中克隆的結果一致。VvARF18蛋白性質及結構與WAN等[19]從葡萄基因組中篩選獲得的VvARF18蛋白類似。VvARF18蛋白與擬南芥AtARF3蛋白結構相類似，而在早期花發育階段中發揮著重要調節作用，推測可能在葡萄花芽發育過程也具有重要的調節作用[36]。啟動子不僅具有核心啟動元件，還在高等植物的基因表達調控中發揮著重要作用[37]。白云赫等[27]發現啟動子中除了含有基本的作用元件之外，還含有光響應作用元件，脅迫相關作用元件及激素類響應元件。而本研究通過對啟動子分析發現，葡萄啟動子中包含多個光信號、生長素和赤霉素相關的順式作用元件，還含有低溫、鹽脅迫及干旱脅迫等逆境脅迫相關的順式作用元件，由此推測可能參與生長素和赤霉素等植物激素信號通路，協同調控葡萄花芽發育進程。

3.2 ARF在花芽分化中的功能

花芽分化是植物開花的前提，植物激素在這個過程中起重要調節作用，并在體內具有一定的動態平衡，且通過平衡互作調控植物花芽分化過程[38]。本研究觀察異源表達的轉基因煙草，發現其花芽分化進程和花器官的形態建成要快于野生型煙草，表明參與植物花芽發育和花器官形態建成過程，與SONG等[39]在果梅（）中的研究結果類似。朝倉花椒（）和在花中的表達水平較高，可能在早期花發育過程中起重要作用[40]。在處于始分化期的葡萄花芽中表達量較高，表明的高表達可能會促進葡萄花芽分化進程[31]。本研究中在轉基因煙草花芽發育的4個時期中呈先升后降的表達趨勢，且在S3時期時表達量達到最高，表明對植物花芽分化進程具有促進作用，與前期研究結果類似[31,40]。植物內源激素是果樹花芽分化的關鍵誘導因子之一，對花芽分化的順利進行起著重要的調控作用。在果梅花芽發育過程中，GA含量變化和的表達趨勢一致；ABA和CTK含量變化總體上與的表達呈相反的趨勢；而在成熟花器官中IAA的含量變化與的表達表現出相反的趨勢[29]。本研究推測可能受到GA與ABA的正調控作用和IAA與CTK負調控作用，協同參與植物花芽分化進程，促進成花誘導，與果梅的研究結果略有不同，主要原因可能是物種與基因功能存在差異。植物的花芽分化不僅受單一激素的影響，也受各種內源激素相互作用，協調達到一種動態平衡關系，調控植物花芽分化進程。CTK/IAA、ABA/IAA、CTK/GA、IAA/GA、ABA/GA之間的動態平衡與綜合作用促進了杏（）的花芽分化，對花期的調控具有重要意義[41]。較高的CTK/IAA、ABA/IAA和GA/IAA的比值有利于棗（）花芽分化和花芽形成[42]。本研究發現GA/IAA的變化模式與的表達趨勢相吻合，推測可能與GA、CTK和ABA信號轉導途徑中的關鍵因子相互作用協同調控植物花芽中的激素水平。

3.3 ARF響應植物激素調控

ARF不僅在植物生長素信號途徑中發揮著重要的作用，對其他植物激素信號轉導調控途徑也產生重要影響[10]。麻風樹（）/在IAA處理1 h后顯著上調表達，推測這些基因可能參與生長素的響應調控[43]。在薔薇科植物月季（）中，的表達量隨著生長素濃度的升高而降低，并以依賴生長素的方式調控雄蕊和花瓣器官的發育[44]。擬南芥AtARF6/8特異性地與轉錄因子BZR1和PIF4相互作用，協同響應GA和IAA激素信號，以調控胚軸細胞伸長和花芽器官的發育[45]。番茄降低的表達可誘發單性果實的形成，在番茄坐果和發育過程中起到IAA和GA激素信號反應調節劑的作用[30]。本研究發現轉基因煙草中的表達量隨IAA濃度的增高而降低，的表達受IAA水平高低的影響。

4 結論

‘紅地球’葡萄位于第13條染色體，含有3個外顯子，2個內含子，其啟動子區域含有光響應、植物激素響應及逆境響應的順式作用元件。參與植物花芽發育過程，對植物花芽分化具有促進作用，其可能通過與GA、CTK和ABA信號轉導途徑中的關鍵因子相互作用協同調控植物花芽中的激素水平，從而促進植物花芽分化的進程。IAA濃度水平能夠影響的表達，與GA在IAA調控植物生長發育和花芽分化過程中可能存在協同作用。

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Functional Analysis ofGene in Red Globe Grape

YUAN Miao, ZHOU Juan, DANG ShiZhuo, TANG XueShen, ZHANG YaHong

College of Enology and Horticulture, Ningxia University, Yinchuan 750021

【Objective】Auxin response factor (ARF) is a significant regulatory factor in the auxin signaling pathway and plays an important role in plant growth and development as well as various physiological processes.Analysis of the Red Globe grapepromoter, heterologous expression, endogenous hormone content and its expression in response to hormones was made in order to explore the mechanism ofgene in the auxin (IAA) signaling pathway and flower bud differentiation process in Red Globe grapes.【Method】Thegene sequence was obtained by homologous cloning by using facility Red Globe grape flower buds as experimental materials. The cis-acting elements of the promoter were analyzed using the online database PLACE. The plant overexpression vector pC2300-was constructed based on the pCAMBIAI2300 plant expression vector by double enzyme digestion and homologous recombination method. The recombinant vector pC2300-was transformed intostrain GV3101 by using electrical shock method. The tobacco leaves were used as explants and transferred into tobacco by-mediated callus transformationmethod, and positive transgenic seedlings were obtained by PCR. The quantitative real-time PCR (qRT-PCR) was used to analyze the expression level oftransgenic tobacco lines, and the transgenic lines with high expression level were screened and cultured to T3 generation, and treated with IAA and GA3to analyze the expression level of. The content of IAA, GA, ABA and CTK in flower buds and leaves of transgenic tobacco were determined by enzyme-linked immunosorbent assay. 【Result】of Red Globe grape located on chromosome 13, and contained 3 exons and 2 introns.There are multiple cis-acting elements in thepromoter region that respond to light, plant hormones, and stress.The phenotypic analysis found that the process of flower bud differentiation was faster in transgenic tobacco than in wild-type tobacco. The qRT-PCR results showed that the expression of VvARF18 showed an increasing and then decreasing trend during the four periods of flower bud development in transgenic tobacco, and the highest expression level was reached in the S3 stage. The results of IAA, CTK, GA and ABA determination in flower buds and leaves of transgenic tobacco plants showed that the content of four plant hormones in flower buds and leaves of transgenic tobacco plants were higher than those of wild-type plants. The change trend of GA/IAA during the four periods of transgenic tobacco flower bud development were consistent with the expression trend of. The expressionlevel ofVvARF18 in transgenic tobacco plants treated with IAA and GA decreased with the increase of IAA treatment concentration and alsodecreased with the extension of GA3treatmenttime.【Conclusion】Grapenegatively regulated auxin to participate in the process of plant flower bud differentiation, which could interact with key factors in the gibberellin signaling pathway to synergistically regulate hormone levels in plant flower buds and had a facilitative effect on plant flower bud differentiation.

Red Globe grape;; transgenic plants; flower bud differentiation; phytohormone

10.3864/j.issn.0578-1752.2024.07.012

2023-05-11；

2024-02-29

寧夏回族自治區重點研發計劃（2021BEF02016）

袁苗，E-mail：yuanmiao970915@163.com。通信作者張亞紅，E-mail：zhyhcau@sina.com

（責任編輯 趙伶俐）