貴州南瓜蒂藥材質量標準提升研究

傅 建 趙燕云 劉艷飛 李美位 張前飛*

1.貴州中醫藥大學藥學院，貴州 貴陽 550025；2.貴陽市食品藥品檢驗檢測中心，貴州 貴陽 550081

南瓜蒂(CucurbitamoschataDuchesne ex Poir)始載于《本草綱目拾遺》[1]，書中言“凡瓜熟皆蒂落，惟南瓜其蒂堅牢不可脫”。南瓜蒂味苦，微甘，性平，歸肺、肝經。有解毒消腫、利水、清熱安胎等功效，主要用于治療癰瘍，疔瘡，燙傷，也可用于瘡潰不斂，水腫腹水，保胎等證[2]。現代藥理學研究[3-5]表明南瓜蒂中的葫蘆素B和E具有廣泛的生物活性，如抗腫瘤、抗肝癌、抗胃癌、保肝及提高機體免疫力等。南瓜蒂收載于《上海市中藥材標準》 (1994年版)[6]和《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》 (2003年版)[7]。由于制定年代較早、基礎研究較為薄弱，只記載了其性狀、顯微鑒別等少數質量檢查項，已無法滿足當前的臨床用藥。為深入了解貴州南瓜蒂的物質基礎，提升其藥材質量標準，筆者對南瓜蒂水分、總灰分、酸不溶性灰分和豆甾醇進行定性和定量研究，為提升貴州南瓜蒂的地方標準，提高用藥安全奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器 高效液相色譜系統(美國安捷倫，Agilent Technologies 1260 InfintyⅡ)；蒸發光散射檢測器(美國格雷斯奧泰，Alltech 3300 ELSD)；超聲波清洗儀(上海科導超聲儀器有限公司，型號：sk8200H)；紫外儀(上海金達生化儀器有限公司)；電子天平(十萬分之一，島津，型號：AUW120D；萬分之一，上海菁海儀器有限公司，型號：FA2204N)。

1.2 材料 甲醇(色譜純，安徽天地高純溶劑有限公司)；無水乙醇(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；硅膠板GF254(青島海洋化工)；鹽酸(優級純，國藥集團化學試劑有限公司)；乙酸乙酯、二氯甲烷(分析純，上海申博化工有限公司)；石油醚(分析純，重慶川東化工集團有限公司)；磷鉬酸(分析純，科密歐化學試劑有限公司)；豆甾醇(上海詩丹德標準技術服務有限公司，大于等于98%)；12批南瓜蒂藥材均采自貴州省不同區域，開陽、德江、江口、綏陽、扎佐、貴陽，由貴州中醫藥大學藥學院生藥教研室孫慶文教授鑒定為葫蘆科植物南瓜(CucurbitamoschataDuchesne ex Poir)的瓜蒂。1～12批次分別用S1～S12表示，藥材信息見表1。12批南瓜蒂批號為：20170901、20170902、20170903、20170904、20170905、20170906、20170907、20170908、20170909、20170910、20170911、20170912。

表1 南瓜蒂飲片產地信息一覽表

2 方法與結果

本文分別對上述12批次的南瓜蒂進行水分、總灰分、酸不溶性灰分、薄層色譜定性鑒別和HPLC-ELSD定量研究。

2.1 水分含量測定 按照2020版《中國藥典》四部(通則0832)的水分測定法第二法(烘干法)[8]。取供試品約2 g，平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，厚度不超過5 mm，精密稱定，開啟瓶蓋在 105 ℃ 干燥5 h，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，放冷30 min，精密稱定，再在上述溫度干燥1 h，放冷，稱重，至連續兩次稱重的差異不超過5 mg為止。根據減失的重量，計算供試品中含水量(%)。結果見表2。

表2 南瓜蒂酸不溶性的測定

2.2 總灰分和酸不溶性灰分 按《中國藥典》2020版第四部(通則2302)的灰分測定法進行測定，對總灰分、酸不溶性灰分進行考察。測定用的南瓜蒂粉碎，通過二號篩，混合均勻后，取供試品約3.0 g，置熾灼恒重的坩堝中，稱定重量(精確至0.01 g)，緩緩熾熱，注意避免燃燒，至完全炭化時，逐漸升高溫度至550 ℃，使完全灰化并至恒重，根據殘渣重量，計算供試品總灰分含量(%)。取上述灰分置于坩堝中，緩慢加入稀鹽酸約10 mL，用表面皿覆蓋坩堝，置水域上加熱10 min，表面皿用熱水5 mL沖洗，洗液放入坩堝中，用無灰濾紙濾過，坩堝內的殘渣用水洗于濾紙上，并洗滌至洗液不顯氯化物反應為止。濾渣連同濾紙移置同一坩堝中，干燥，熾灼至恒重。根據殘渣重量，計算供試品中算不溶性灰分的含量(%)。結果見表2。

2.3 豆甾醇定性分析(薄層色譜法)

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取10 mg豆甾醇對照品，加甲醇溶解并定容至10 mL，搖勻，制成1 mg/mL的豆甾醇溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取不同批號的南瓜蒂打粉后，過三號篩，分別精密稱取1.000 g置于具塞三角瓶中，分別加入20 mL甲醇，超聲1 h，補足減失的重量。精密量取續濾液25 μL，蒸干，殘渣加甲醇使溶解，定容至10 mL，濾過，取續濾液，即得。

2.3.3 定性分析 取上述制備好的對照品溶液與供試品溶液，分別點于硅膠GF254薄層板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯(20∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外儀下觀察后，噴以5%磷鉬酸試劑，用熱風槍加熱至斑點顯色清晰。觀察供試品與對照品斑點的位置。結果圖1所示，豆甾醇與南瓜蒂藥材在相同的Rf值處顯示對應的斑點。初步確定南瓜蒂藥材及飲片中含有豆甾醇，為了進一步證實，接下來將采用高效液相色譜-蒸發光散射法進行驗證。

1.豆甾醇對照品；2.貴州扎佐；3.貴州綏陽；4.貴州江口；5.貴州貴陽；6.貴州貴陽；7.貴州貴陽；8.貴州開陽；9.貴州開陽；10.貴州開陽；11.貴州德江；12貴州德江；13.貴州德江

2.4 豆甾醇含量測定(高效液相色譜-蒸發光散射法)

2.4.1 對照品溶液的制備 精密稱定，豆甾醇對照品2.58 mg，加甲醇溶解并定容至10 mL，即得。

2.4.2 供試品溶液的制備 按照“2.3.2 供試品溶液的制備”項下制備供試品。

2.4.3 色譜條件 InertustainC18色譜柱(4.6 nm×250 nm，5 μm)，檢測器為ELSD，流動相為甲醇-水(90∶10)，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，漂移管溫度80 ℃，氣體體積流量1.5 mL·min-1，進樣量20 μL。色譜圖如圖2所示。

注：上圖為對照品色譜圖；下圖為供試品色譜圖

2.4.4 線性關系考察 精密吸取不同體積的對照品2 μL、5 μL、10 μL、12 μL、15 μL、18 μL、20 μL，按照“2.4.3”項色譜條件下測定峰面積，以峰面積為縱坐標，進樣濃度為橫坐標，繪制標準曲線。回歸方程為Y=2.0×107X-855.48 (r=0.9994)。結果表明進樣量在0.050×10-3～0.500×10-3mg范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系。如圖3所示。

圖3 線性關系圖

2.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液20 μL，連續進樣6次，測定其峰面積。結果：對照品峰面積的RSD為1.6%(n=6)，說明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 精密稱定樣品6份，每份5.0 g，分別按照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按上述“2.4.3”項色譜條件測定其峰面積。結果6份供試液含量的RSD為1.67%(n=6)，含量平均值為0.0444 μg/g，說明樣品重復性良好。

2.7 穩定性 按照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h進行測定其峰面積。結果表明供試品的峰面積的RSD為1.22%，說明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.8 加樣回收率實驗 精密稱定已測得含量的樣品6份，每份2.5 g，分別精密加入一定體積的對照品溶液，再根據供試品制備的方法制備，按“2.4.3”項的色譜條件進行測定。結果表明6份的平均回收率為98.95%，RSD為2.29%，回收率良好。結果見表3。

表3 回收率試驗結果 (n=6)

2.9 樣品含量測定 按照上述“2.3.2”供試品制備方法和“2.4.3”色譜條件下測定貴州不同地區南瓜蒂的含量。結果見表4。

表4 樣品測定結果

采用HPLC-ELSD法測定了來自于貴州省12批南瓜蒂藥材中豆甾醇的含量。結果顯示貴州南瓜蒂中均含有豆甾醇，但是含量差別較大。

3 討論

3.1 指標性成分的選擇 文獻報道南瓜蒂中安胎的主要成分是葫蘆素B[9]，所以本文首先對貴州不同地區南瓜蒂的葫蘆素B進行研究，但是通過TLC和HPLC檢測，并未從貴州南瓜蒂中檢測到葫蘆素B。與此同時，報道南瓜蒂中也含有β-谷甾醇[10]，同樣通過TLC和HPLC-ELSD測定，也未從上述12批次貴州南瓜蒂中檢測到β-谷甾醇。因此最終選擇豆甾醇作為檢測對象。

3.2 薄層色譜法 分別考察了豆甾醇不同的展開劑系統，如氯仿-甲醇、石油醚-乙酸乙酯、二氯甲烷-乙酸乙酯，最后確定二氯甲烷-乙酸乙酯為最佳展開系統，并對不同的比例(4∶1，8∶1，20∶1)進行了篩選，結果表明比例在20∶1時，Rf值適中。

3.3 高效液相色譜法 豆甾醇結構中不含共軛系統，在紫外下不顯示熒光，故在TLC檢測時采用5%磷鉬酸顯色。ELSD是萜類、皂苷類等化合物較為適宜的檢測器[11]，因此本試驗選用ELSD器對其進行測定，方法簡便，結果準確、可靠、重復性好，可作為本品質量控制方法之一。

綜上，本研究增加南瓜蒂藥材質量標準中水分、灰分檢查，采用TLC定性分析豆甾醇，并首次采用HPLC-ELSD法測定貴州南瓜蒂中豆甾醇含量，完善南瓜蒂藥材質量控標準，所建立的檢查限度合理，含量測定方法專屬性較強，精密度較高，重復性較好，為提升南瓜蒂藥材質量標準提供參考。