UPLC-QQQ-MS法檢測(cè)孕康口服液中驢皮源和牛皮源成分

黎嘉茗 張萬(wàn)青 劉瀟瀟

廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510663

目前，市場(chǎng)上驢皮資源緊缺且價(jià)格高昂，少數(shù)藥品企業(yè)可能會(huì)為了尋求更高的經(jīng)濟(jì)效益，將牛皮充當(dāng)阿膠投料或摻偽，影響用藥安全，為了保證藥品的質(zhì)量及提高檢測(cè)的專屬性，藥品監(jiān)管部門頒布了一系列膠類原料和制劑的檢測(cè)方法[1-4]。孕康口服液作為臨床常用藥，由山藥、續(xù)斷、阿膠等二十三味中藥材組成，具有健脾固腎，養(yǎng)血安胎的功效，臨床用于腎虛型和氣血虛弱型先兆流產(chǎn)和習(xí)慣性流產(chǎn)，該藥收載于中國(guó)藥典2020年版一部[2]，但是正文項(xiàng)下并無(wú)膠類成分的檢測(cè)項(xiàng)目。這種由中藥材中的阿膠專屬性檢測(cè)方法的缺失，使以摻偽阿膠投料或少投料、不投料生產(chǎn)中成藥的現(xiàn)象有了存在的空間。為了保證藥品的質(zhì)量及提高檢測(cè)的專屬性，作者結(jié)合相關(guān)研究[5-8]，以超高效液相-三重四極桿質(zhì)譜儀建立了含膠類中藥孕康口服液中驢皮源及牛皮源成分的專屬性檢測(cè)方法，并進(jìn)行了相關(guān)方法學(xué)驗(yàn)證，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters XevoTQ-S三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀；DK-8D型電熱恒溫水槽；KQ-300DE型超聲清洗器；sartorius CP225D電子天平；100 μL BRAND移液槍；10 μL BRAND移液槍。

1.2 對(duì)照品 阿膠對(duì)照藥材(批號(hào)：121274-201703，中國(guó)食品藥品檢定研究院)，黃明膠對(duì)照藥材(批號(hào)：121695-201301，中國(guó)食品藥品檢定研究院)。

1.3 試藥與試劑 孕康口服液樣品10批，樣品均為線上藥店采購(gòu)，詳見(jiàn)樣品信息表1。乙腈(批號(hào)：A801556)、甲酸(批號(hào)：A543804)均購(gòu)自默沙東公司；碳酸氫銨(批號(hào)：20221001)購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠；胰蛋白酶(批號(hào)：0000138466)購(gòu)于普洛麥格(北京)生物科技有限公司。水為純化水。

表1 樣品信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜-質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 照高效液相色譜-質(zhì)譜法(中國(guó)藥典2020年版通則0512、0431)，以ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)為色譜柱；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相B，按表2進(jìn)行梯度洗脫；流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣量為5 μL。

表2 梯度洗脫程序

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用質(zhì)譜檢測(cè)器，電噴霧正離子模式(ESI+)，噴霧電壓為3.1 kV，鞘氣為20 Arb，輔助氣為8 Arb，離子傳輸管溫度350 ℃，蒸發(fā)溫度350 ℃，掃描模式為 MRM，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，選擇2020年版《中國(guó)藥典》一部阿膠[2]項(xiàng)下的檢測(cè)離子對(duì)與m/z 641.3(雙電荷)→726.2和m/z 641.3(雙電荷)→783.3作為檢測(cè)離子對(duì)，碰撞能量分別為16 V和20 V，要求檢測(cè)離子對(duì)測(cè)定的MRM色譜峰的信噪比大于10∶1。牛皮源質(zhì)譜參數(shù)詳見(jiàn)表3。

表3 質(zhì)譜參數(shù)

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液制備 取本品4.0 mL，精密量取，置50 mL量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液40 mL，超聲處理30 min，加1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液100 μL，置微量進(jìn)樣瓶中，加胰蛋白酶溶液10 μL，搖勻，37 ℃恒溫酶解12 h，即得。

2.2.2 陰性樣品溶液制備 取不含牛皮源的樣品，精密稱定，照供試品溶液制備方法制得。

2.2.3 黃明膠對(duì)照藥材溶液制備 取黃明膠對(duì)照藥材粉末0.1 g，置50 mL量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液40 mL，超聲處理30 min，加1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液100 μL，置微量進(jìn)樣瓶中，加胰蛋白酶溶液10 μL，搖勻，37 ℃恒溫酶解12 h，即得。

2.2.4 阿膠對(duì)照藥材溶液制備 取阿膠對(duì)照藥材粉末0.1 g，自“置50 mL量瓶中”起，同黃明膠對(duì)照藥材溶液制備的制備方法。

2.2.5 牛皮源參比溶液制備 取黃明膠對(duì)照藥材0.10 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液40 mL，超聲處理30 min，加1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液 5 mL，置100 mL量瓶中，加阿膠對(duì)照藥材粉末0.20 g，加1%碳酸氫銨溶液80 mL，超聲處理30 min，再加1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液100 μL，置微量進(jìn)樣瓶中，加胰蛋白酶溶液10 μL，搖勻，37 ℃ 恒溫酶解12 h，即得。

2.2.6 胰蛋白酶溶液的制備 取序列分析級(jí)胰蛋白酶適量，加1%碳酸氫銨溶液制成每1 mL中含1 mg的溶液，作為胰蛋白酶溶液。本溶液臨用新配。

在基層社會(huì)治理的模式構(gòu)建中有三大要素對(duì)社會(huì)治理效果發(fā)揮著重要作用，分別是基礎(chǔ)保障性要素、創(chuàng)新協(xié)同性要素和工具性要素。誠(chéng)然，在社區(qū)治理中對(duì)社區(qū)治理主體進(jìn)行簡(jiǎn)單的分類并沒(méi)有實(shí)質(zhì)性的意義，在歸類基礎(chǔ)上對(duì)其結(jié)構(gòu)和資源的整合以及流程的再造才是要素區(qū)分的要義。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察 以m/z 641.3(雙電荷)→726.2，783.3作為檢測(cè)離子對(duì)，按檢測(cè)條件，分別檢測(cè)合格樣品、陰性樣品、阿膠對(duì)照藥材、黃明膠對(duì)照藥材，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陰性樣品未檢測(cè)出牛皮源特征離子對(duì)，說(shuō)明孕康口服液中其它藥味對(duì)牛皮源的檢測(cè)無(wú)干擾。如圖1、圖2所示。

圖1 牛皮源特征肽離子色譜圖

圖2 驢皮源特征肽離子色譜圖

2.3.2 基質(zhì)效應(yīng) 取1 mL黃明膠對(duì)照藥材溶液4份，置20 mL容量瓶中，分別以1%碳酸氫銨溶液、阿膠基質(zhì)溶液、自制樣品溶液稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液100 μL，置微量進(jìn)樣瓶中，加胰蛋白酶溶液10 μL，搖勻，37 ℃恒溫酶解12 h，即得。

結(jié)果表明，以自制樣品基質(zhì)比以阿膠基質(zhì)的響應(yīng)值略小。本檢查方法以阿膠基質(zhì)代替自制樣品基質(zhì)制備參比溶液，相當(dāng)于適當(dāng)放寬檢出限度。詳見(jiàn)表4。

2.3.3 線性關(guān)系 取黃明膠0.1 g，置50 mL量瓶中，加1% 碳酸氫銨溶液至刻度，搖勻。吸取上述對(duì)照品溶液0.2 mL、0.4 mL、1 mL、2 mL、4 mL、10 mL，置20 mL量瓶中，加0.69 g自制樣品(相當(dāng)于含0.04 g阿膠的樣品量)，分別制得0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、1 mg/mL黃明膠的系列對(duì)照藥材溶液(相當(dāng)于投料的阿膠中摻入1%、2%、5%、10%、20%、50%的黃明膠)，按上述色譜條件，注入液相色譜儀，測(cè)得峰面積。以峰面積值為縱坐標(biāo)，阿膠中摻入黃明膠的量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算回歸方程：m/z 641.3(雙電荷)→783.3：Y=58834X-33.48，r2=0.995；m/z 641.3(雙電荷)→762.2：Y=80995X-410.4，r2=0.995，在1%～10%范圍內(nèi)，黃明膠摻入量與色譜峰面積成正比關(guān)系。結(jié)果見(jiàn)表5和如圖3、圖4所示。

圖3 黃明膠摻入量與色譜峰面積的線性關(guān)系圖(m/z 641.3→726.2)

圖4 黃明膠摻入量與色譜峰面積的線性關(guān)系圖(m/z 641.3→783.3)

表5 黃明膠摻入量與黃明膠特征肽的峰面積線性關(guān)系

2.3.4 檢測(cè)限 以m/z 641.3(雙電荷)→726.2，783.3作為檢測(cè)離子對(duì)，取黃明膠對(duì)照藥材溶液，用自制樣品溶液逐級(jí)稀釋。濃度為0.001 mg/mL黃明膠溶液(相當(dāng)于投料的阿膠中摻入0.05%黃明膠)特征峰m/z 641.3→783.3的信噪比為3.51，滿足信噪比3的要求，作為本次試驗(yàn)的檢測(cè)限。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品(批號(hào)：170601)平行制備6份，以黃明膠特征分子離子峰m/z 641.3→726.2，783.3作為檢測(cè)離子對(duì)進(jìn)行測(cè)定，比較峰面積。結(jié)果6份樣品均檢出相應(yīng)的黃明膠特征分子離子峰。結(jié)果見(jiàn)表6，峰面積和保留時(shí)間的RSD均<10%，說(shuō)明該法重復(fù)性良好。

表6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品(批號(hào)：170601)，按擬定方法制備供試品溶液，分別于2 h、6 h、8 h、12 h、16 h、20 h內(nèi)進(jìn)樣測(cè)定，提取黃明膠特征分子離子峰m/z 641.3→726.2，783.3，比較保留時(shí)間和峰面積(表7)。結(jié)果表明，樣品在24 h內(nèi)符合黃明膠檢查的要求。

表7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品測(cè)定結(jié)果 10批孕康口服液均檢出驢皮源成分，并且均未檢出牛皮源成分。見(jiàn)表8。

表8 樣品檢測(cè)結(jié)果

3 討論

分別采用Waters XevoTMTQ-S、Agilent G6460 Triple Quad兩臺(tái)質(zhì)譜檢測(cè)器，ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)、Agilent SB-C1(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)兩根色譜柱，以m/z641.3→726.2，783.3作為選擇離子進(jìn)行檢測(cè)，考察該法的耐用性。結(jié)果參比溶液的信噪比均大于10，可滿足檢驗(yàn)要求。

制劑阿膠摻偽主要為牛皮源，本品種暫缺乏相關(guān)研究。本次項(xiàng)目組研究驢皮源與牛皮源的摻偽檢測(cè)方法，采用三重四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)器結(jié)合本次研究的方法對(duì)10批孕康口服液進(jìn)行檢驗(yàn)，檢測(cè)是否混入雜皮藥材生產(chǎn)孕康口服液。該方法的建立，為進(jìn)一步了解相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量狀況提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和方法依據(jù)。

綜上，本研究建立的專屬性檢測(cè)方法，經(jīng)過(guò)對(duì)多批次產(chǎn)品的驗(yàn)證，陰性無(wú)干擾，方法的專屬性較強(qiáng)。能有效控制孕康口服液的投料，對(duì)孕康口服液中驢皮源及牛皮源成分的檢測(cè)提供了一個(gè)有效的補(bǔ)充方法。