Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選改良型正骨靈活血止痛膏成型工藝

易曉霞 劉志友 崔 虹 黃海軍 付 萍 謝 曉

重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校附屬中醫(yī)院，重慶 404000

黑膏藥是我國(guó)中藥制劑中的一種傳統(tǒng)劑型，其應(yīng)用迄今為止已經(jīng)約有兩千年的歷史[1]，在外治法中治療肌膚紅腫、癰疽、瘡瘍和跌打損傷、風(fēng)濕痹痛等方面具有獨(dú)特的療效[2]。正骨靈活血止痛膏處方來(lái)自三峽庫(kù)區(qū)名老中醫(yī)萬(wàn)瑤仙的祖?zhèn)髅胤剑怯扇橄恪](méi)藥、生地黃、當(dāng)歸等組成的黑膏藥，具有活血化瘀、消腫止痛之效，用于急、慢性閉合性軟組織損傷、勞損等疾病，取得了很好的療效[3]。本課題立足傳統(tǒng)醫(yī)藥的守正創(chuàng)新，以傳統(tǒng)用藥經(jīng)驗(yàn)為指導(dǎo)，面向中藥復(fù)方制劑開(kāi)發(fā)研究需要，精準(zhǔn)鎖定正骨靈活血止痛膏原工藝存在的不足之處進(jìn)行工藝改良。為了克服原工藝單一油提對(duì)有效成分提取不完全的缺點(diǎn)，設(shè)計(jì)水提工藝和油提工藝相結(jié)合的方法，避免水溶性有效成分損失。如何將水提清膏與油提稠膏兩者混溶成型是亟待解決的難題，影響成型工藝的關(guān)鍵因素有蜂蠟用量、水提清膏與油提稠膏的混合溫度和水提清膏料液比。響應(yīng)面法用于多因素影響的復(fù)雜實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更為科學(xué)、合理[4]。故在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別法和客觀物理參數(shù)法相結(jié)合的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選改良型黑膏藥成型工藝，以期為后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 數(shù)顯溫度計(jì)(江蘇林工電氣有限公司)；HH-4型恒溫水浴鍋(江蘇金壇市中大儀器廠)；DHG-9030A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；攤凃機(jī)、JR-32型手動(dòng)沖壓機(jī)(臺(tái)州北美機(jī)械制造有限公司)；LA 114 型電子天平(常熟市百靈天平儀器有限公司)；HR-2806E型瀝青軟化點(diǎn)測(cè)定儀(滄州華屹試驗(yàn)儀器有限公司)；HG-810型初粘性測(cè)試儀(東莞市華國(guó)精密儀器有限公司)；持黏力實(shí)驗(yàn)板(濟(jì)南阿爾法電子設(shè)備有限公司)；80-2型離心沉淀機(jī)(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司)，CQ-6型超聲波清洗器(上海滬超超聲波儀器有限公司)。

1.2 試藥 生地黃(批號(hào)：21101)，當(dāng)歸(批號(hào)：210801-01)，山楂(批號(hào)：210802-01)，黃柏(批號(hào)：211201-01)，紅花(批號(hào)：211201-03)，地榆(批號(hào)：211201-02)，赤芍(批號(hào)：201201-04)、乳香(批號(hào)：211101)，沒(méi)藥(批號(hào)：211201)，海螵蛸(批號(hào)：211101-05)及黃丹(批號(hào)：220101)，蜂蠟(批號(hào)：220701)均由重慶泰爾森制藥有限公司提供，經(jīng)重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校附屬中醫(yī)院劉志友主任中藥師鑒定為正品。黃柏對(duì)照藥材(批號(hào)：121510-201807)，芍藥苷(批號(hào)：110736-202246)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。硅膠GF254預(yù)制板(批號(hào)：020230102，煙臺(tái)江友硅膠開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn))，正骨靈活血止痛膏由重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校附屬中醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，檢驗(yàn)合格。

2 方法與結(jié)果

2.1 改良型黑膏藥的制備

2.2.1 前期試驗(yàn)確定的提取工藝 稱取生地黃、當(dāng)歸、山楂、黃柏、紅花、地榆、赤芍共360 g，加10倍量水浸泡1.5 h，提取1 h，提取1次，濾過(guò)，濾液濃縮至清膏，量取體積，計(jì)算水提清膏料液比。藥渣80 ℃烘干6 h，備用。稱取乳香、沒(méi)藥、海螵蛸共360 g，與備用藥渣一同置于裝有植物油2500 g的鍋內(nèi)油炸15 min，炸至焦枯而不炭化(油溫220 ℃)，去渣，濾過(guò)。藥油煉制20 min，煉至滴水成珠(油溫320 ℃)。藥油離火(油溫不低于280 ℃)，不斷攪拌，緩緩篩入黃丹(炒干，水分<10%)1250 g，攪勻，收膏，即得油提稠膏。如圖1所示。

圖1 改良型黑膏藥制備工藝流程圖

2.2.2 成型工藝 以油提稠膏重量計(jì)，稱取一定比例的蜂蠟(A)，加入到熔融的油提稠膏，混勻。保持一定的混合溫度(B)，再加入一定料液比(C)的水提清膏，混勻成型。取膏熔化，用攤凃機(jī)滴注在裱背材料上，稱取一定重量，覆蓋隔離膜，用手動(dòng)沖壓機(jī)壓制成圓形，即得。

2.2 綜合評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.2.1 傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別法 參照《中華人民共和國(guó)藥典》2020版四部通則0186膏藥項(xiàng)下[5]黑膏藥應(yīng)烏黑，無(wú)紅斑。膏體應(yīng)油潤(rùn)細(xì)膩、光亮、老嫩適度，攤涂均勻、無(wú)飛邊缺口，加溫后能粘貼于皮膚上且不移動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)將從軟硬度、移動(dòng)性、殘留性、刺激性這些方面來(lái)考察。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。選擇3位經(jīng)驗(yàn)豐富的中藥專業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別法評(píng)分，取平均值。

表1 傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別法評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.2.2 客觀物理參數(shù)法

2.2.2.1 軟化點(diǎn) 參照《中華人民共和國(guó)藥典》2020版四部通則2102 膏藥軟化點(diǎn)測(cè)定法項(xiàng)下[5]，讀取鋼球剛觸及下支撐板表面時(shí)的溫度，求每組2份供試品平均值，作為軟化點(diǎn)。

2.2.2.2 初黏力 參照《中華人民共和國(guó)藥典》2020版四部通0952 黏附力測(cè)定法項(xiàng)下[5]，將供試品背襯固定于與水平面成30°的膠帶初粘性試驗(yàn)機(jī)上，鋼球自斜面自由落下，記錄供試品能粘住最大球號(hào)鋼球的直徑D(dm)和位移的距離S(m)，計(jì)算初黏力N[6]，N=10.354D3+1.035D3/S(設(shè)鋼球比重為 7.8 g/cm-3，重力加速度為 9.8 m/s-2)，求每組3份供試品平均值，作為初黏力。

2.2.2.3 持黏力 參照2020版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則0952 黏附力測(cè)定法項(xiàng)下[5]，將供試品粘性面貼于試驗(yàn)板，垂直放置，沿供試品長(zhǎng)度方向懸掛500 g的砝碼，記錄供試品滑移直至脫落的時(shí)間，求每組3份供試品平均值，作為持黏力。

2.2.3 綜合評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別法評(píng)分=(軟硬度得分/最大軟硬度得分)×20+(移動(dòng)性得分/最大移動(dòng)性得分)×20+(殘留性得分/最大殘留性得分)×20+(刺激性得分/最大刺激性得分)×40。客觀物理參數(shù)法評(píng)分=(軟化點(diǎn)/最大軟化點(diǎn))×40+(初黏力/最大初黏力)×30+(持黏力/最長(zhǎng)持黏力)×30。為了更客觀地評(píng)價(jià)，綜合評(píng)分R1=傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別法評(píng)分×40%+客觀物理參數(shù)法評(píng)分×60%。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 蜂蠟用量的影響 選擇蜂蠟用量為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，料液比為2∶1 g/mL，混合溫度為70 ℃，按“2.1”項(xiàng)制備，“2.2”項(xiàng)綜合評(píng)分，結(jié)果如圖2所示。確定響應(yīng)面考察蜂蠟用量影響因素的范圍[7]為1.5%～2.5%。

圖2 蜂蠟用量對(duì)綜合評(píng)分的影響圖

2.3.2 混合溫度的影響 選擇混合溫度為40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃、120 ℃，蜂蠟用量為1.5%，料液比為2∶1 g/mL，按“2.1”項(xiàng)制備，“2.2”項(xiàng)綜合評(píng)分。結(jié)果如圖3所示。確定響應(yīng)面考察混合溫度影響因素的范圍為60～100 ℃。

圖3 混合溫度對(duì)綜合評(píng)分的影響圖

2.3.3 料液比的影響 選擇料液比為1∶1 g/mL、1.5∶1 g/mL、2∶1 g/mL、2.5∶1 g/mL、3∶1 g/mL，蜂蠟用量為1.5%，混合溫度為70 ℃，按“2.1”項(xiàng)制備，“2.2”項(xiàng)綜合評(píng)分，結(jié)果如圖4所示。確定響應(yīng)面考察料液比影響因素的范圍為2∶1～3∶1 g/mL。

圖4 料液比對(duì)綜合評(píng)分的影響圖

圖5 蜂蠟用量和混合溫度，蜂蠟用量和料液比，混合溫度和料液比交互作用對(duì)綜合評(píng)分R1影響的響應(yīng)面圖

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)

2.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素結(jié)果，選取蜂蠟用量(A)、混合溫度(B)、料液比(C)為考察對(duì)象，以綜合評(píng)分R1為響應(yīng)指標(biāo)。采用Design-Expert 11.0 設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)。見(jiàn)表2。按“2.1”項(xiàng)制備，“2.2”項(xiàng)綜合評(píng)分。結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

表3 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

2.4.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析 由圖4看出，BC交互的等高線圖密集、呈橢圓形，響應(yīng)面圖最陡峭，交互作用最強(qiáng)；AB、BC交互的等高線圖較密集、呈圓形，響應(yīng)面圖稍陡，交互作用較強(qiáng)[11]。所得的結(jié)論與方差分析結(jié)果一致。

2.4.4 最優(yōu)成型工藝參數(shù)的預(yù)測(cè) 最優(yōu)成型工藝參數(shù)為：蜂蠟用量為1.882%，混合溫度為80.757 ℃，料液比為2.553 g/mL，Y預(yù)測(cè)值為91.286。考慮實(shí)際可操作性，將最優(yōu)工藝修正參數(shù)為：蜂蠟用量為1.9%，混合溫度為81 ℃，料液比為 2.5∶1 g/mL。

2.4.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)修正的最優(yōu)成型工藝制備3批樣品，照“2.2”項(xiàng)進(jìn)行綜合評(píng)分，作為Y實(shí)測(cè)值。3批樣品綜合評(píng)分RSD=0.86%<5%，重現(xiàn)性好，工藝穩(wěn)定。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果求算其偏差值[12]，偏差(%)=|(預(yù)測(cè)值-實(shí)測(cè)值)|預(yù)測(cè)值×100%。結(jié)果見(jiàn)表5。平均偏差為1.23%，表明建立的模型具有較好的預(yù)測(cè)性，因而該最優(yōu)工藝參數(shù)可以作為改良型黑膏藥成型工藝。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 (n=3)

2.5 離心穩(wěn)定性 為了考察水提清膏與油提稠膏混溶的穩(wěn)定性，參考乳劑的考察指標(biāo)[13]，取3批樣品各5 g置于離心管中，以3.5×103r/min的轉(zhuǎn)速離心30 min。結(jié)果顯示，改良型正骨靈活血止痛膏無(wú)分層現(xiàn)象，穩(wěn)定性較好。

2.6 薄層色譜鑒別

2.6.1 黃柏 取10張改良型黑膏藥剪成小塊，加石油醚(30～60 ℃)140 mL，加熱回流6 h，樣品晾干，加甲醇20 mL，超聲處理40 min，濾過(guò)，濾液濃縮至2 mL，作為改良型黑膏藥供試品溶液。10張?jiān)诟嗨帲ㄖ瞥稍诟嗨幑┰嚻啡芤骸Ｈ〔缓S柏的陰性對(duì)照品10張，同法制成陰性對(duì)照品溶液。另取黃柏對(duì)照藥材0.1 g，加甲醇20 mL同法制成對(duì)照藥材溶液。吸取上述4種溶液各2～5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，改良型黑膏藥在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的亮黃色斑點(diǎn)，原黑膏藥在與對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上，無(wú)相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。結(jié)果如圖6所示。

1.黃柏對(duì)照藥材溶液；2.供試品溶液(改良型)；3.供試品溶液(原)；4.陰性對(duì)照品溶液

2.6.2 赤芍 取10張改良型黑膏藥剪成小塊，加石油醚(30～60 ℃)140 mL，加熱回流6 h，樣品晾干，加乙醇20 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL，作為改良型黑膏藥供試品溶液。取10張?jiān)诟嗨帲ㄖ瞥稍诟嗨幑┰嚻啡芤骸Ｈ〔缓嗌值年幮詫?duì)照品10張，同法制成陰性對(duì)照品溶液。另取芍藥苷對(duì)照品2 mg，加乙醇1 mL制成對(duì)照品溶液。吸取上述四種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰[14]，供試品色譜中，改良型黑膏藥在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的藍(lán)紫色斑點(diǎn)，原黑膏藥在與對(duì)照品相應(yīng)的位置上，無(wú)相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。結(jié)果如圖7所示。

1.芍藥苷對(duì)照品溶液；2.供試品溶液(改良型)；3.供試品溶液(原)；4.陰性對(duì)照品溶液

3 討論

3.1 質(zhì)量控制 由于黑膏藥工藝的特殊性，上市品種少，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局搜索“膏藥”有141個(gè)批準(zhǔn)文號(hào)，去重后發(fā)現(xiàn)僅有70個(gè)品種；醫(yī)療機(jī)構(gòu)、個(gè)體診所應(yīng)用多，質(zhì)量參差不齊，原因之一是缺乏全面反映黑膏藥質(zhì)量的客觀指標(biāo)和檢測(cè)方法[15]。傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別技術(shù)往往只掌握在老藥工手上，多以“拉之成絲而易斷，揉之黏手而不粘”來(lái)判斷老嫩程度，“貼之即粘，揭之即起”[16]來(lái)判斷黏附力，具有主觀性，單憑經(jīng)驗(yàn)不利于有效地傳承與推廣。藥典通則規(guī)定的軟化點(diǎn)只能反映黑膏藥的軟硬度，不足以反映其黏性、揭扯性，因此本試驗(yàn)增加了客觀指標(biāo)初黏力、持黏力的測(cè)定。采用傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別法與客觀物理參數(shù)法相結(jié)合之法，多維度地評(píng)價(jià)黑膏藥的質(zhì)量，才能優(yōu)選出最佳的成型工藝，以質(zhì)量促生產(chǎn)。

3.2 工藝優(yōu)化 為了減少或避免有效成分在高溫熬煉時(shí)損失，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)藥物有效成分的理化性質(zhì)選擇將處方中部分中藥飲片先水提濃縮成清膏，再與油提稠膏混勻的方法。如直接混合，在生產(chǎn)或貯存過(guò)程中油水容易分層，加入助溶基質(zhì)可增加其穩(wěn)定性。前期從助溶基質(zhì)蜂蠟、羊毛脂、凡士林中，篩選出蜂蠟為成型工藝的助溶劑。加入蜂蠟的改良型黑膏藥油水混合較好，形成類似油包水乳霜[17]。不僅如此，蜂蠟還具有減“火毒”、增止痛之效及調(diào)節(jié)軟化點(diǎn)的作用。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蜂蠟熔點(diǎn)在62 ℃以上，熔化后在加入油提稠膏過(guò)程中，四周遇冷部分會(huì)凝固在容器上，造成用量偏差，解決之法是將蜂蠟粉碎成細(xì)粉后分散其中。在今后的研究中，應(yīng)注意蜂蠟對(duì)藥物釋放、吸收的影響。響應(yīng)面法有效地探索出各因素間相互之間的影響，進(jìn)行組合后得到高精度的回歸方程，預(yù)測(cè)出最優(yōu)成型工藝條件，并經(jīng)過(guò)驗(yàn)證。改良型黑膏藥綜合評(píng)分比原黑膏藥提高了27.71%。薄層色譜檢測(cè)結(jié)果顯示改良型黑膏藥在與對(duì)照品、對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色斑點(diǎn)，原黑膏藥無(wú)相同顏色斑點(diǎn)，證實(shí)水提與油提相結(jié)合的改良工藝保留了水溶性有效成分，質(zhì)量有所提升。療效與質(zhì)量是否一致，對(duì)改良型正骨靈活血止痛膏成型工藝的優(yōu)化為后續(xù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和臨床療效及安全性對(duì)比研究提供保障，為傳統(tǒng)黑膏藥的守正創(chuàng)新奠定基礎(chǔ)。