HPLC切換波長法同時(shí)測定散痰止咳露中5種成分

桂立華

云南省食品藥品審核查驗(yàn)中心，云南 昆明 650106

散痰止咳露是曲靖市第一人民醫(yī)院制劑，由麻黃、苦杏仁、川芎、桔梗、黃芩、法半夏、連翹、化橘紅、甘草、枇杷葉(密炙)10味中藥制成。具有止咳平喘、祛風(fēng)化痰之功效，用于上感咳嗽、急、慢性氣管炎。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，苦杏仁具有降氣止咳平喘、潤腸通便之功能，連翹具有清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風(fēng)熱之功能，化橘紅具有理氣寬中、燥濕化痰之功能，黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎之功能。現(xiàn)代藥理研究表明，苦杏仁苷具有止咳平喘、抗胃潰瘍等藥理作用，是苦杏仁藥理活性主要成分[1]；連翹酯苷A具有抗炎、抗氧化等作用，是連翹主要特征性有效成分之一[2]；柚皮苷具有消炎、止咳、平喘等藥理作用，是化橘紅的有效成分之一[3]；黃芩苷、漢黃芩苷等黃酮類化合物具有具有解熱、抗病毒、抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等作用，是黃芩藥理作用中主要的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[4]。該制劑經(jīng)過近20年的臨床使用，療效確切。但現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，僅對連翹、麻黃進(jìn)行薄層色譜鑒別，不利于其質(zhì)量控制，中藥制劑成分復(fù)雜，很有必要對多成分進(jìn)行測定，從而很好的服務(wù)臨床。本文參考《中國藥典》[5]及文獻(xiàn)[6-19]，分別選擇苦杏仁苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷和漢黃芩苷為苦杏仁、連翹、化橘紅、黃芩的質(zhì)控指標(biāo)，建立了HPLC法同時(shí)測定散痰止咳露中苦杏仁苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷含量的方法，為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供支撐。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-20AT型高效液相色譜儀(Shimadzu公司)，UV-2401型紫外可見分光光度計(jì)(Shimadzu公司)，XS105型電子天平(Mettler Toledo公司)。

1.2 材料 苦杏仁苷(批號(hào)：110820-201808，含量：88.2%)、連翹酯苷A(批號(hào)：111810-201606，含量：93.4%)、柚皮苷(批號(hào)：110722-201714，含量：93.4%)、黃芩苷(批號(hào)：110715-201720，含量：93.5%)、漢黃芩苷對照品(批號(hào)：112002-201702，含量：98.5%)，以上對照品均購置于中國食品藥品檢定研究院；散痰止咳露(批號(hào)：20200721，20200816，20200530，曲靖市第一人民醫(yī)院制劑室)；乙腈為色譜純(Merck KGaA公司)；水為超純水(自制)；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 依利特C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相0.1%磷酸(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0～50 min，20%→60% B，50.01～60 min，20% B)；檢測波長：0～34 min，210 nm(苦杏仁苷、連翹酯苷A、柚皮苷)；34～60 min，275 nm(黃芩苷、漢黃芩苷)體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取苦杏仁苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷對照品適量，用80%甲醇制成分別含上述對照品0.5757 mg/mL、0.2484 mg/mL、0.6044 mg/mL、1.0256 mg/mL、0.2219 mg/mL的混合對照品儲(chǔ)備液。精密量取上述混合對照品儲(chǔ)備液1 mL，置10 mL容量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密量取供試品1 mL，置100 mL容量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻，靜置，取上清液，濾過，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方工藝與比例，分別制得缺苦杏仁、缺連翹、缺化橘紅、缺黃芩的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下制成陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性與專屬性試驗(yàn) 分別吸取“2.2”項(xiàng)下的溶液各10 μL，在“2.1”色譜條件下測定，結(jié)果5種成分各峰的對稱因子為 0.90～1.10，分離度均大于1.5，陰性樣品在與對照品和供試品色譜峰保留時(shí)間相應(yīng)位置上沒有色譜峰，陰性樣品不干擾測定。如圖1所示。

(A)混合對照品 (B)供試品 (C)缺苦杏仁陰性樣品

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對照品儲(chǔ)備液0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、5.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。濾液分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。以對照品質(zhì)量濃度(X)、峰面積(Y)分別為橫、縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1，5種成分在各自的線性范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

表1 5種成分的線性關(guān)系

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對照品溶液進(jìn)樣6次，每次10 μL，記錄峰面積。結(jié)果，苦杏仁苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷峰面積的RSD分別為0.15%、0.09%、0.21%、0.24%、0.16%。儀器有良好的精密度。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào)：20200721)6份，按“2.2.2”項(xiàng)下制備，測定苦杏仁苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷的含量，其含量的RSD分別為0.69%、0.76%、063%、0.58%、0.71%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一“2.2.2”項(xiàng)下制備的樣品，室溫放置，分別在0 h、4 h、8 h、16 h、24 h時(shí)進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。結(jié)果，苦杏仁苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷峰面積的RSD分別為0.60%、0.49%、0.72%、0.85%、0.64%，表明樣品在24 h內(nèi)有良好的穩(wěn)定性。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取測定含量的散痰止咳露(批號(hào)：20200721)6份，每份0.5 mL，分別置100 mL容量瓶中，精密加入“2.2.1”項(xiàng)下的混合對照品儲(chǔ)備液5 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下制備。測得回收率見表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.9 樣品測定結(jié)果 取5批散痰止咳露，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備，測定含量，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，苦杏仁苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷5種成分含量平均值(RSD)分別為5.5499(7.02%)、1.9492(6.15%)、5.6408(4.26%)、9.0479(4.11%)、2.0463(13.11%)，說明5種成分5批次含量之間存在一定差異，特別漢黃芩苷差異較大，其含量RSD達(dá)13.11%，產(chǎn)生這種差異的原因可能與處方中各藥材的產(chǎn)地、采收季節(jié)、生長年限、炮制方法等多種因素有關(guān)。為保證制劑的質(zhì)量穩(wěn)定性，使臨床療效更有保障，很有必要對多成分進(jìn)行含量測定。

表3 樣品含量測定結(jié)果 (mg/mL，n=3)

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 分別取苦杏仁苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷對照品溶液在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，苦杏仁苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷分別在210 nm、218 nm、212 nm、277 nm、275 nm處有最大吸收。曾嘗試用同一波長進(jìn)行測定，用210 nm時(shí)，黃芩苷、漢黃芩苷峰響應(yīng)較小，用275 nm時(shí)，苦杏仁苷、連翹酯苷A、柚皮苷峰響應(yīng)較小。最終定為切換波長法進(jìn)行檢測。

3.2 提取方法的選擇 由于樣品為液體制劑，根據(jù)該制劑工藝并結(jié)合待測成分的溶解性，選擇用不同濃度(60%、70%、80%、100%)的甲醇作為溶媒，當(dāng)用80%的甲醇作為溶媒時(shí)，5種待測成分回收率好，且雜質(zhì)干擾較小，因此將80%的甲醇確定為本試驗(yàn)的溶媒。

3.3 流動(dòng)相的選擇 參考《中國藥典》[5]及文獻(xiàn)[6-19]，先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，預(yù)試驗(yàn)流動(dòng)相為甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸以及乙腈-0.1%磷酸系統(tǒng)，預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)時(shí)，黃芩苷峰拖尾較重，后在甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸系統(tǒng)中試驗(yàn)，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)流動(dòng)相比例及梯度，當(dāng)為乙腈-0.1%磷酸系統(tǒng)時(shí)，反復(fù)調(diào)整流動(dòng)相比例及梯度，苦杏仁苷均分離不好，用甲醇-0.1%磷酸系統(tǒng)時(shí)，經(jīng)反復(fù)調(diào)整流動(dòng)相比例及梯度，5種待測成分峰形和分離度均能達(dá)到良好效果，最終確定甲醇-0.1%磷酸并進(jìn)行梯度洗脫為本試驗(yàn)的流動(dòng)相。

綜上所述，本研究建立了HPLC切換波長的方法對散痰止咳露中苦杏仁苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷5種成分的含量進(jìn)行了同時(shí)檢測。由于中藥制劑成分復(fù)雜，其臨床療效是多成分共同作用的結(jié)果，建立多成分含量測定的方法很有必要，本研究建立了散痰止咳露的多成分含量測定的方法，填補(bǔ)了該制劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無含量測定的空白，為今后更好挖掘散痰止咳露的臨床價(jià)值奠定了基礎(chǔ)。該方法操作簡單、專屬性強(qiáng)、精密度高、重現(xiàn)性好，可用于散痰止咳露中多成分的含量進(jìn)行測定。