膝痹膏皮膚用藥安全性研究

郭童童 李鴻飛 郭熙英 劉俊昌

1.北京兒童醫院新疆醫院/新疆維吾爾自治區兒童醫院，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆醫科大學，新疆 烏魯木齊 830011

膝痹膏處方源自《千金翼方·卷十六·諸膏第三》蒼梧道士陳元膏，并且在《肘后救卒方》《千金要方》等書中均有記載，其中記載“患膝冷痛，摩之五日，亦愈”。在古方的基礎上，依據新疆醫科大學針灸推拿系王新軍主任多年在臨床中對于治療膝痹病的研究，篩選藥物并確定了本方的君臣佐使及功效。本方由當歸、秋水仙、黑附片、干姜，細辛、白芷等藥材運用現代方法與傳統制藥工藝精制而成。本方治療氣滯血瘀、風寒濕痹證，現代多用于治療膝關節骨性關節炎(osteoarthritis of the knee KOA)。為探討該藥安全性，此次實驗將從皮膚刺激性、皮膚過敏性兩個方面研究，為臨床使用提供依據。

1 實驗儀器與試藥

1.1 試藥 膝痹膏(實驗室自制)，空白基質實驗室自制，2，4一二硝基氯苯(陽性對照品)。

1.2 儀器 XS105型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.3 動物 兔，普通級，體重2.10～2.80 kg，雌雄各半。豚鼠，普通級，體重280～350 g，雌雄各半，均由新疆醫科大學北校區動物中心提供，合格證號：SCXK(新)2018-0001。動物房溫度：(25±1)℃，相對濕度：50% ～ 70% 。實驗期間動物單獨分籠飼養，標準飼料喂養，自然光照。

2 方法與結果

2.1 膝痹膏皮膚刺激性實驗[1-6]

2.1.1 單次給藥的皮膚刺激性實驗 將膝痹膏涂抹于兔左側脊柱部位，右側不涂作為空白對照，觀察兔皮膚接觸膝痹膏后所產生的刺激性反應。采用兔同體左右自身對比法，實驗兔4只，雌雄各半，隨機分為4組，每組1只。正常皮膚A、B組和破損皮膚C、D組。將家兔脊柱兩側的毛剪去后，再用刮刀進一步去毛處理，左右各一塊，去毛范圍為3 cm×3 cm。破損皮膚組在用藥區域劃“井”字，以滲出血為度。完整皮膚A組左側涂膝痹膏供試品0.2 g，右側作為空白對照。破損皮膚組C左側涂膝痹膏供試品0.2 g，右側涂等量空白基質。涂藥后蓋上一層紗布，用無刺激性膠布固定。分籠飼養，涂藥24 h后，用溫水或生理鹽水洗去殘留藥膏，去除藥膏后 1 h、24 h、48 h、72 h。觀察并記錄涂抹部位是否出現紅斑及水腫等現象。刺激反應的評價標準見表1、表2，試驗結果見表3。

表1 皮膚刺激性反應評分標準

表2 皮膚刺激性強度評價標準

表3 膝痹膏對兔皮膚刺激性反應結果(單次給藥)

2.1.2 多次給藥的皮膚刺激性實驗 分別在完整皮膚組B組和破損皮膚組D組家兔的脫毛區上藥，左側脫毛區涂膝痹膏0.2 g，右側脫毛區涂空白基質0.2 g，每天涂藥1次，涂藥后用無菌紗布覆蓋，并用膠布進一步固定，用藥6 h，連續7 d。在末次用藥6 h后取下紗布，用溫水或生理鹽水洗去殘余藥膏，洗去藥膏后繼續觀察1周，每次涂藥前及停藥后，觀察并記錄動物給藥部位皮膚是否出現紅斑、水腫等現象進一步觀察涂抹部位是否出現色素沉著、皮膚粗糙或皮膚菲薄、有無出血點等情況。刺激反應的評價標準見表1、表2，試驗結果見表4。

表4 膝痹膏對兔皮膚刺激性反應結果(多次給藥)

公式：每組動物平均積分值=∑紅斑和水腫積分/受試動物數。

試驗結果見表3，表4，結果表明，在兔的完整皮膚組和破損皮膚組局部進行單次和多次膝痹膏劑給藥的皮膚刺激性試驗，各組皮膚刺激反應平均分值均為0，用藥部位均未出現紅斑、水腫現象。多次給藥刺激性實驗結果表明，完整皮膚給藥組及破損皮膚給藥組與空白基質對照組相比，各時間點的皮膚刺激反應平均分值均為0，刺激強度評價均為無刺激性，給藥部位也均未出見色素沉著、皮膚粗糙、出血點等現象。說明膝痹膏劑外用對皮膚完全且無刺激性。

2.2 膝痹膏皮膚過敏性實驗 豚鼠8只，分為給藥組(自制膝痹膏劑)4只，空白對照組2只及陽性對照組(2，4一二硝基氯苯)2只，于試驗前一日用剪刀將其背部毛減去，再用刮刀拐去殘余毛發，實驗面積為3 cm×3 cm，觀察24 h，并驗證脫毛區無紅斑、水腫、破損。

2.2.1 致敏接觸 將已備皮的豚鼠8只，分別涂抹膝痹膏、空白基質、陽性對照藥各0.2 g，先用一層玻璃紙將藥膏均勻涂抹在受試部位，再兩層無菌紗布覆蓋，最后用無刺激膠布進行加固，用藥持續6 h后，用溫水或生理鹽水洗去殘余藥膏，在第7天、第14天，以相同方法各重復1次，共計3次。

2.2.2 激發致敏 于末次給藥致敏后第13天，將豚鼠肋腹部去毛，方法及面積同背部，次日，于肋腹部脫毛區涂抹膝痹膏、空白基質、陽性對照藥(0.1% 2，4-二硝基氯代苯)各0.4 g，6 h后用溫水洗掉受試物，即刻觀察，然后于24 h、48 h、72 h再次觀察皮膚過敏反應情況。根據表5對豚鼠紅斑和水腫情況進行評分，按表6進行過敏反應強度評價。

表5 豚鼠皮膚過敏反應評分標準

表6 豚鼠皮膚過敏性評價標準

2.2.3 試驗結果 觀察結果表明，在致敏0 d、7 d、14 d后，膝痹膏供試品、空白基質陰性對照組的豚鼠均未出現紅斑、水腫等現象，而陽性對照組均出現了不同程度的紅斑。并且24 h、48 h，膝痹膏供試品、空白基質陰性對照組的豚鼠均未出現紅斑、水腫等現象，而陽性對照組均出現了不同程度的紅斑，致敏率高達100%。實驗結果見表7。

表7 豚鼠皮膚過敏比較試驗結果

3 討論

兔對刺激敏感，反應近似于人，常用于藥品、化妝品的局部刺激性試驗。豚鼠過敏試驗屬于I型超敏反應，是一個經典的動物過敏性試驗。故本章節選用兔為動物實驗模型，參照皮膚刺激性實驗指導原則，設計了膝痹膏外用單次及多次涂藥的皮膚刺激性實驗，結果表明膝痹膏外用對兔的完整或破損皮膚均無刺激性。選用豚鼠為皮膚過敏動物實驗模型，與空白基質、陽性對照藥(0.1% 2，4-二硝基氯代苯)相比，結果表明膝痹膏外用后未出現紅腫、水腫等過敏現象。為其臨床用藥提供了實驗數據及理論依據。