常綠鉤吻堿對人結腸癌細胞增殖、凋亡的影響

陳 亮，聶平平

福州市中醫院，福建 福州 350001

鉤吻，又名斷腸草、大茶藥、野葛等，為馬錢科植物胡蔓藤Gelsemiumelegans(Gardn.etchamp) Benth.的全草，是有毒植物，在我國主要分布在我國浙江、福建、廣東、廣西、貴州、云南等地[1]。鉤吻具有破瘕積的功效[2]，現代藥理研究[3]發現鉤吻具有鎮痛、抗炎、抗腫瘤等作用。曾有醫者將鉤吻總生物堿制成注射劑應用于臨床治療癌性疼痛取得一定療效[4]，鉤吻生物堿的毒性也對其臨床應用帶來一定限制，也需要進一步研究相關作用機制，以便能夠更好地應用于臨床。筆者前期研究發現鉤吻中提取出的常綠鉤吻堿具有較強抑制人結腸癌細胞HT-29增殖的作用，但是具體機制尚未明確。本研究利用MTT實驗、DAPI染色及western-blot等研究方法，從Bcl-2/Bax途徑誘導細胞凋亡的角度出發，探討常綠鉤吻堿抗結腸癌作用的機制。

1 材料

1.1 藥物與細胞 常綠鉤吻堿，由昆山遠慕生物技術有限公司提供(純度>99%，貨號YM-0065)，配制前用二甲基亞砜(DMSO)溶液配制成5 mg/mL的母液，于4 ℃保存待用。人結腸癌HT-29細胞株，由江蘇凱基生物技術股份有限公司提供(貨號KGG3225-1)。

1.2 試劑和儀器 南美胎牛血清(美國Hyclone公司，貨號SV30087.02)；雙抗青鏈酶素(10000units/mL，10000μg/mL鏈霉素。美國Hyclone公司，貨號SV30010)；McCoys’5A液體培養基(武漢博士德公司，貨號PYG0026)；胰蛋白酶-EDTA(美國Hyclone公司，貨號SH30042.01)；二甲基亞砜(DMSO)溶液(北京索萊寶公司，貨號D8371)；噻唑藍(MTT)干粉(江蘇凱基公司，貨號KGH3101-1)；細胞凋亡DAPI染色劑試劑盒(江蘇凱基公司，貨號KGA215)；RIPA細胞裂解液(上海碧云天公司，貨號P0013B)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天公司，貨號P0011)；一抗稀釋液(上海碧云天公司，貨號P0023A)；二抗稀釋液(上海碧云天公司，貨號P0023D)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(上海碧云天公司，貨號P0012A)；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(上海碧云天公司，貨號P0015)；超敏ECL化學發光試劑盒(上海碧云天公司，貨號P0018S)；β-actin蛋白一抗(英國abcam公司，貨號ab8226)；Bcl-2蛋白一抗(英國abcam公司，貨號ab59348)；Bax蛋白一抗(英國abcam公司，貨號ab32503)；二抗(北京全式金公司，貨號HS201-01、HS101-01)；ELX800酶標儀(美國BioTek公司)；二氧化碳培養箱(中國力康公司)；IX7熒光倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；潔凈工作臺(蘇州泰安空氣技術有限公司)；25 cm2培養瓶、96孔培養板、6孔培養板(美國Corning公司)；Gel DOC 2000 型凝膠成像分析系統(美國Bio-rad公司)。

2 方法

2.1 HT-29細胞培養 用含10%胎牛血清、1%雙抗青鏈酶素的McCoys’5A液體培養基置于37℃、5%CO2培養箱中培養。

2.2 MTT實驗 取對數生長期的HT-29細胞用0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞以McCoys’5A培養液制成細胞懸液，調整細胞密度為5×104個/mL分別接種于3塊96孔培養板中，每孔100 μL，常規培養24 h后，使細胞貼壁。吸棄原培養液，根據前期預實驗觀察到常綠鉤吻堿對HT-29細胞增殖的抑制情況，將細胞分為實驗組(常綠鉤吻堿終質量濃度分別為4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL的培養液培養)，對照組(等體積不含常綠鉤吻堿的培養液培養)及調零組(不含細胞直接加等體積的培養液)，以上5組各設6個復孔，培養24 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，37 ℃孵育4 h，然后吸取各孔中的液體加入二甲基亞砜(DMSO)100 μL/孔 ，振蕩混勻，并于室溫放置10 min，使結晶充分溶解并混勻，在ELX800酶標儀于570 nm處測定5組吸光度值(即OD值)，抑制率=1-(實驗組-調零組)/(對照組-調零組)。以上實驗重復3次。

2.3 細胞形態學觀察 將取對數生長期的HT-29接種于6孔培養板中，每孔2 mL培養液，常規培養24 h后，吸棄原培養液，細胞分為實驗組(用常綠鉤吻堿終質量濃度分別為4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL的培養液培養)，對照組(等體積不含常綠鉤吻堿的培養液培養)。HT-29細胞用常綠鉤吻堿干預培養24 h后，用IX7熒光倒置相差顯微鏡觀察細胞的形態及變化，并拍照。

2.4 DAPI染色液染色觀察 HT-29細胞的凋亡情況 將取對數生長期的HT-29接種于6孔培養板中，每孔2 mL培養液，常規培養24 h后，吸棄原培養液，細胞分為實驗組(用常綠鉤吻堿終質量濃度分別為4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL的培養液培養)，對照組(等體積不含常綠鉤吻堿的培養液培養)，HT-29細胞用常綠鉤吻堿干預培養24 h后，吸棄原培養液，每孔用1 μg/mL的DAPI染色液500 μL漂洗后，棄去染色液，每孔再加1 μg/mL的DAPI染色液500 μL，37 ℃孵育染色15 min，棄去染色液，后每孔加500 μL無水甲醇溶液漂洗，棄去甲醇溶液，每孔加入500μL Buffer后，用IX7熒光倒置相差顯微鏡觀察細胞的凋亡情況。

2.5 western-blot檢測Bcl-2和Bax蛋白 取對數生長期的HT-29細胞胰酶消化后，取3×106個/mL接種于6孔板中，每孔2 mL培養液，常規培養24 h后。吸棄原培養液，細胞分為實驗組(用常綠鉤吻堿終質量濃度分別為4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL的培養液培養)，對照組(直接加等體積的培養液)。繼續培養24 h后，用預冷的PBS洗滌2次，收集細胞加入細胞裂解液150 μL，4 ℃裂解30 min，收集細胞裂解液，14000 rpm離心15 min，收集上清液，BCA試劑測定蛋白含量，加入5×蛋白上樣緩沖液至終濃度為1×，100 ℃蛋白變性5 min，上樣于SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠，每孔20 μg蛋白進行電泳分離。將蛋白轉至PVDF膜，加入含5%脫脂奶粉封閉液封閉2 h，一抗(β-actin、Bcl-2、Bax蛋白用一抗稀釋液1∶1000稀釋)4 ℃過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，二抗(以1∶8000用二抗稀釋液稀釋)室溫孵育2 h，TBST漂洗3遍，每遍10 min，ECL化學發光顯色，以β-actin為內參基因，用Image Lab軟件進行顯色分析，以上實驗重復3次。

3 結果

3.1 常綠鉤吻堿對于HT-29細胞增殖的影響 質量濃度4 μg/mL常綠鉤吻堿干預24 h后，即對HT-29細胞增殖有明顯的抑制作用(P<0.05)。隨著藥物濃度的提高及干預時間的延長，HT-29的抑制率也升高，呈明顯的時間劑量依賴。8 μg/mL常綠鉤吻堿干預24 h后，對 HT-29 細胞增殖的平均抑制率可達58.81%，使用SPSS 17.0計算IC50約為7.48 μg/mL。詳見表1。

表1 常綠鉤吻堿對于HT-29細胞增殖的影響情況表(常綠鉤吻堿干預 24 h)

3.2 常綠鉤吻堿對于HT-29細胞形態的影響(干預24 h) 空白對照組細胞胞質均勻，細胞核仁清晰，呈良好的貼壁生長，如圖1A所示。實驗組當常綠鉤吻堿質量濃度為4 μg/mL作用24 h時，可明顯觀察到細胞胞質混濁，細胞體積縮小，開始出現細胞懸浮、脫落，甚至死亡，如圖1B所示；隨著劑量的增加細胞狀態越差，細胞數量逐漸減少如圖1C和圖1D所示。實驗結果顯示常綠鉤吻堿對于HT-29細胞有明顯的抑制作用，并隨濃度的增加逐漸增強，呈現一定的量效關系。

A.0 μg/mL；B.4 μg/mL；C.6 μg/mL；D.8 μg/mL

3.3 常綠鉤吻堿對于HT-29細胞凋亡的影響(干預24 h) DAPI染色劑染色后，空白對照組HT-29細胞染色均勻，細胞核呈圓形，邊緣清晰，如圖2A所示。實驗組常綠鉤吻堿干預后凋亡的細胞出現藍色熒光，細胞核邊緣不規則，核小體碎片增加。隨著藥物劑量的增加，HT-29細胞的數量逐漸減少，表明常綠鉤吻堿可促進HT-29細胞凋亡。如圖2B、C、D所示。

A.0 μg/mL；B.4 μg/mL；C.6 μg/mL；D.8 μg/mL

3.4 western-blot檢測 常綠鉤吻堿對于HT-29細胞Bcl-2、Bax蛋白表達的影響(干預24 h) 與對照組相比，實驗組各組Bcl-2蛋白的表達逐漸降低(P<0.05)，而Bax蛋白的表達無明顯變化(P>0.05)，表明常綠鉤吻堿可降低HT-29細胞Bcl-2蛋白的表達，但對Bax蛋白的表達無明顯影響。如圖3和圖4所示。

圖3 常綠鉤吻堿對HT-29細胞Bcl-2、Bax蛋白表達影響的電泳情況圖

注：與對照組相比，*P<0.05，**P>0.05

4 討論

細胞凋亡是機體維持穩定的重要保護機制之一，細胞凋亡率的減少是腫瘤發生的關鍵性步驟。腫瘤發展過程中增殖與凋亡平衡的破壞，導致腫瘤細胞無限增殖[5]。

Bcl-2和Bax蛋白均屬于Bcl-2家族，Bcl-2可抑制細胞凋亡，Bax則為促凋亡蛋白，Bcl-2家族是凋亡調控的重要分子，在腫瘤中Bcl-2家族成員表達異常，導致腫瘤細胞能夠逃逸凋亡，保持持續的增殖能力，Bcl-2定位于線粒體膜，Bax則主要以單體形式定位于細胞漿，當受到凋亡刺激時，Bax發生構象改變，從胞漿移位到線粒體外膜形成二聚體或寡聚體并插入線粒體膜，導致線粒體跨膜電位下降和促凋亡分子的釋放，進而促發線粒體介導的凋亡通路，Bcl-2可與Bax形成異二聚體，阻礙Bax等促凋亡蛋白的功能，抑制細胞色素C(Cyt-c)和凋亡誘導因子(AIF)的釋放，起到抑制細胞凋亡的作用[6]。Bcl-2/Bax異常升高可見于多種腫瘤之中，Bax/Bcl-2與細胞凋亡密切相關[7]。

結腸癌是一種發病率和死亡率都很高的惡性腫瘤[8]。結腸癌的發病與遺傳、環境因素、飲食及生活習慣均密切相關，其發病涉及多因素、多個階段及不同基因的變化。細胞凋亡程序的失常與結腸癌的發病密切相關。有研究表明Bcl-2表達量可影響結腸組織的惡變程度，從而影響結腸癌的發生發展[9]。

目前，中藥的抗腫瘤作用越來越受到重視，以其副作用少、療效確切的特點受到許多研究者關注。中藥對于逆轉腫瘤耐藥也具有一定作用[10]。研究中藥中的有效抗腫瘤成分將有助于抗腫瘤藥物的研發。隨著對中藥生物堿研究的不斷深入，越來越多的生物堿被發現具有抗腫瘤作用，中藥生物堿成分的抗腫瘤機制主要有抑制腫瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡，抑制細胞侵襲轉移，影響腫瘤細胞自噬和調節免疫功能等，可通過調控 PI3K/AKT、AKT/mTOR、JNK/p38 MAPK、Wnt/β-catenin 等相關信號通路，多環節、多途徑參與到腫瘤增殖、凋亡、侵襲轉移及自噬過程中，影響腫瘤的發生發展[11]。

鉤吻含有鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己、鉤吻綠堿等多種生物堿成分[12]。吳達榮等[13]的實驗證明鉤吻生物堿的主要成分鉤吻素子在體外對于人結腸癌細胞Lovo有抑制作用。黃靜等[14]也通過實驗發現鉤吻生物堿中的鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己和1-甲氧基鉤吻堿對人結腸癌細胞SW480增殖具有顯著的抑制作用。本課題前期研究[15]發現鉤吻總生物堿可抑制人結腸癌HT-29細胞的增殖，也可抑制人臍靜脈內皮細胞HUVEC的增殖及遷移[16]，具有一定抑制血管新生的作用。常綠鉤吻堿是鉤吻生物堿中含有的單體成分之一。有研究[17]通過體外細胞培養及裸鼠移植瘤實驗發現常綠鉤吻堿可抑制人神經膠質瘤細胞U251生長，用100 mg/kg的常綠鉤吻堿灌胃給藥小鼠時也未發現對正常小鼠存在明顯毒性作用。目前鉤吻生物堿抗腫瘤作用的研究仍較少，本研究通過常綠鉤吻堿體外作用于HT-29細胞，利用MTT試驗及倒置相差顯微鏡觀察到常綠鉤吻堿可抑制人結腸癌細胞HT-29的增殖，表現出明顯量效關系。另外，通過DAPI染色法證實常綠鉤吻堿可促進HT-29細胞凋亡。western-blot檢測發現常綠鉤吻堿可顯著下調Bcl-2的蛋白表達(P<0.05)，對Bax的蛋白表達未見明顯影響(P>0.05)。由此我們推測常綠鉤吻堿可能通過減少HT-29細胞Bcl-2蛋白的表達，從而減輕細胞對凋亡的抑制作用，而非直接促進細胞凋亡，因而對Bax蛋白的表達無明顯影響。這也為常綠生物堿抗腫瘤作用的研究提供了一定理論參考。