核桃仁發育過程中不同形態酚及其抗氧化活性的動態變化

崔茂凱，王若輝，2，李慶楊，沈丹玉，劉毅華

（中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所1，杭州 311400）

（渭南市林業工作站2，渭南 714000）

我國核桃產量和種植面積位居世界前列。近年研究發現核桃富含的天然多酚類物質可有效降低糖尿病、關節炎等慢性發病率［1］，并被認為與其抗氧化功能有明顯關系［2－4］。因此核桃仁中酚類化合物鑒定與功能活性成為國內外研究熱點［5，6］。但現有關于酚類化合物的研究主要聚焦于游離態酚。根據可萃取性和與食物細胞壁組分的相互作用，酚類形態可以分成游離態、酯化態以及結合態。近年有關酯化態和結合態酚健康效應研究表明，它們對人體腸道菌群健康有著游離態酚不具備的益處［7］。因此很多學者提出僅關注游離態酚有可能低估了核桃仁等富含酚類食品中實際酚含量與抗氧化能力［8］。前期在建立核桃仁中3 種形態酚提取及其LC －MS／MS鑒定方法的過程中，也初步發現酯化、結合態酚具有較好抗氧化能力［9］。

酚類物質在植物整個發育過程中會經歷一系列復雜的生物合成、代謝反應，導致其含量和抗氧化功能均隨成熟度發生改變。鱷梨核中游離態總酚含量及其抗氧化活性隨成熟度增加而升高［10］。而芒果核中游離態總酚含量隨成熟度的增加而降低，其中含量豐富的沒食子酸游離態含量也在成熟階段顯著下降［11］。

研究者們進一步通過探明酚類物質在成熟過程中的形成和活性變化，以確定農產品最適的采摘期或最大限度利用其營養價值以開發相應的功能食品。有研究發現早采收的柑橘中總黃酮和酚類物質含量較晚采收果實高［12］。對成熟過程中釀酒葡萄多酚的含量的變化規律的探索直接與葡萄酒品質改善和高價值葡萄酒開發相關［13］。在高粱籽粒中發現多種黃酮類多酚化合物如兒茶素、表兒茶素等隨成熟度增加而變化的規律更有利于選育優質高粱種質資源和開發相關副產品［14］。而關于泡核桃（Juglans sigillata Dode）‘黔核7 號’最新研究表明在種仁充實期總酚和抗氧化能力均較高，因此在該時期采收其營養價值和風味更佳［15］。但目前針對普通核桃（Juglans regia L.）種仁中不同形態酚類物質含量、抗氧化能力與采收時期三者之間的關系還不甚了解，因此探究三者之間關系對核桃品質調控和功能產品的開發具有重要價值。

本研究對不同發育期收獲核桃仁中3 種形態的酚類物質及其抗氧化能力進行定量分析，討論了成熟度對其酚類成分和抗氧化能力的影響。研究結果對于核桃的適時采摘和營養管理以及核桃仁深度開發利用等提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究選取的核桃品種‘寒豐’來自遼寧省大連市核桃種質資源圃，土壤類型為棕壤土。2020 年9月18 日是受試核桃完全成熟期（以青皮開裂2／3 衡量），整個核桃果實發育成熟期間共進行4 次采樣，分別為采前63 d、采前49 d、采前21 d以及成熟期這4 個時期。

采用棋盤法確定采樣樹，選取生長旺盛且無明顯病蟲害，樹齡為10 ～15 年核桃樹，在每棵樹的上部和下部、東南西北4 點均勻采集核桃果實3 kg，避光帶冰運輸至實驗室待處理。

1.2 儀器和試劑

1290 LC／6460 QQQ液相色譜／串聯四極桿質譜聯用儀，723N 可見分光光度計，FD － 1D － 80 凍干機。

冰醋酸、石油醚（沸程30 ～60 ℃）、碳酸鈉；福林酚試劑、單體酚標樣（純度＞98%）；色譜級丙酮、乙腈、甲酸。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗材料預處理

將核桃青皮去除，并且剝開外層硬殼得到核桃仁。隨后用液氮處理核桃仁，將核桃仁表面的內種皮去除后置于冷凍干燥機中15 h。將凍干后的仁磨成均質粉末，稱取10 g脫內種皮仁粉末，置于50 mL的石油醚（沸程為30 ～60 ℃）中浸泡，在振蕩器上以160 r／min的速度振蕩12 h。隨后進行抽濾，獲得脫脂的脫內種皮仁（簡稱為核桃仁）粉末放入－20 ℃冰箱保存，用于后續的實驗。

1.3.2 游離態、酯化態和結合態的提取

稱取核桃仁粉末1 g 于50 mL 離心管中，加入15 mL體積分數為70%丙酮水溶液，用均質儀均質20 s，在超聲水浴條件下提取30 min（溫度不高于40℃），以8 000 r／min在離心機中離心5 min，取上層提取液，重復步驟3 次，將提取液合并。旋轉蒸發掉提取液中的丙酮后，隨后用2 mol／L的鹽酸將剩余液體的pH調至2.0，再用乙酸乙酯提取3 次，合并上層清液；將此時的上清液旋轉蒸發至干，并且加入10 mL甲醇試劑定容，最終得到游離態酚提取物。將2 mL的2 mol／L 氫氧化鈉溶液加入下層水溶液中，堿解1 h后用2 mol／L鹽酸將pH 調至2.0 后，再用乙酸乙酯提取3 次，合并上層清液且旋轉蒸發至干，最終加入10 mL甲醇試劑定容，得到酯化態酚提取物。將2 mL的2 mol／L氫氧化鈉溶液加入余下的固體殘渣中堿解1 h，用2 mol／L 鹽酸將pH 調至2.0 后，再用乙酸乙酯提取3 次，合并上層清液且旋轉蒸發至干，最終加入10 mL 甲醇試劑定容，得到結合態酚提取物。

1.3.3 3 種形態酚的總酚含量測定

采用福林－酚比色法［16］對不同形態酚的總酚含量進行測定。

1.3.4 UPLC－MS／MS測定3 種形態酚

液相色譜條件：選用色譜柱Poroshell 120 EC －C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），流動相A 是體積分數為0.05%甲酸水溶液，流動相B 為V乙腈∶V甲醇＝4∶1，儀器梯度洗脫程序為（0 min：體積分數15% ～20% B，12 min：50% B，15 min：60% B，17 ～19 min：95% B，19 ～20 min：15% B），要求流速為0.3 mL／min，進樣量5 μL，柱溫為40 ℃。

質譜條件：1290 LC／6460 QQQ液相色譜／串聯四極桿質譜，電噴霧（ESI）離子源，掃描方式為多反應監測模式（DMRM），在全掃描模式下對比正負離子模式中酚類成分的響應情況，在MS／MS 模式下從母離子得到二級碎片離子的全掃描質譜圖，選擇豐度和相對分子質量高的碎片離子，優化碰撞能和電壓，得到最優條件。離子源溫度300 ℃，干燥氣（N2）流量11 L／h，毛細管電噴霧電壓3 500 V。

1.3.5 清除自由基能力的測定

根據Hazli等［17］的方法測定1，1 －二苯基－2 －苦肼基（DPPH）。

1.3.6 數據分析

本實驗數據在Microsoft Excel 2019 進行整理和初步分析，采用SPSS 23.0 對實驗數據進行相關性分析，采用Origin 2019 軟件制圖化。

2 結果與分析

2.1 核桃仁發育過程中不同形態總酚含量的變化

隨著核桃果實發育成熟，3 種形態總酚含量變化如圖1 所示。游離態酚含量在采前63 d時達到最大值（10.47 mg／g），然后在采前49 d 時下降至最小值（0.86 mg／g）。之后隨著成熟度增加游離態酚總含量緩慢回升，成熟期達到2.03 mg／g。類似的游離態酚變化趨勢在香蕉［18］、檸檬和柑橘［19］等水果研究也有發現。Salvatore等［19］發現來自意大利的檸檬等柑橘類水果在成熟期均表現游離態酚含量下降的趨勢，其中檸檬游離酚含量降幅超過50%。然而也有研究表明4 個品種的藍莓游離酚含量均在成熟期顯著上升，甚至超過未成熟早期含量1 ～3 倍［20］。對3個品種橄欖的研究發現［21］，其中2 個品種橄欖游離酚含量在整個成熟期都表現出相當穩定，另一品種橄欖游離酚含量在成熟后期達到峰值。這表明游離酚總含量的變化規律不僅與物種有關，也受品種、地區等因素的影響。

圖1 3 種形態酚總含量隨成熟度的變化

與游離態酚類似，酯化態總酚含量峰值也出現在采前63 d（2. 76 mg／g），并是成熟期含量（0. 95 mg／g）的2.9 倍。結合態總酚含量在采前63 d（1.28 mg／g）最高，而其余時期酚含量均低于1.00 mg／g。從整體看，3 種形態酚含量在臨近成熟期過程中含量逐漸升高，其原因與內源激素、發育時期以及外界因素（光、溫度、傷害）等影響有關［26］。從整個發育過程的3 種形態酚總含量來看，游離態酚含量占比始終在58%以上，說明核桃仁動態發育過程中游離態是核桃仁酚類物質的主要形態。

2.2 核桃仁發育過程中不同形態總酚抗氧化活性情況

以往的核桃酚類化合物抗氧化活性的研究中［23，24］，對于結合態和酯化態酚的活性沒有深入探究。本研究結果表明在核桃仁成熟發育過程中游離態酚的抗氧化活性始終高于同時期其他2 種酚（表1），尤其是在采前63 d時，游離態酚的IC50值（14.62 μg／mL）是酯化態（43.63 μg／mL）和結合態（321.16 μg／mL）的3、22 倍。核桃仁的DPPH 自由基清除能力受不同成熟時期的影響，且與核桃品種有關。如‘清香’和‘維納’的DPPH自由基清除能力在成熟期呈增加趨勢，‘西林3 號’‘香玲’等品種的DPPH 自由基清除能力最大值比‘清香’和‘維納’要提前20 d［25］。此外還發現3 種形態酚的抗氧化活性變化趨勢有差異。雖然3 種形態酚的抗氧化活性最大值都出現在果實的未成熟初期，但結合態、酯化態酚抗氧化活性在采前63 d 時為最大值（結合態IC50為322.50 μg／mL，酯化態IC50為43.0 μg／mL），而游離態酚略晚于前兩者，抗氧化活性最大值出現在采前49 d時（IC50為9.80 μg／mL）。從整個時期來看，酯化態酚的DPPH自由基IC50從43.30 μg／mL（采前63 d）逐漸增加到988.90 μg／mL（成熟期），而結合態酚雖然在未成熟期內從322.50 μg／mL（采前63 d）上升到790. 00 μg／mL（采前21 d），但在成熟期時（343.60 μg／mL）其IC50值回升至接近其采前63 d時（322.50 μg／mL），并且僅為成熟期游離態酚IC50的3倍左右。這表明在成熟期結合態酚對酚整體抗氧化活性有著不可忽視作用。苦蕎芽菜在萌發過程中游離態酚提取物的含量和抗氧化性遠遠高于結合態酚，其中萌發第7 天中含量豐富的蘆丁、槲皮素游離態含量分別是結合態的141.4 倍和20.0 倍［26］。而甘蔗汁中酚類物質大部分以結合態形式存在，含量是游離態酚的2 倍以上［27］。但游離態酚的DPPH自由基IC50值卻是結合態酚的0.55 倍，并且含量豐富的單體酚如咖啡酸、沒食子酸更多以游離態存在。所以推測各形態酚的抗氧化活性強弱可能不僅與各形態酚總含量有關，也受含量居多的單體酚存在形態的影響。

表1 DPPH法測定各形態酚自由基的IC50值／μg／mL

2.3 核桃仁發育過程中不同形態單體酚含量的變化以及與總酚含量、抗氧化活性的相關性

2.3.1 不同形態單體酚含量變化

如圖2 ～圖4 所示，核桃仁在成熟發育過程中共鑒定出26 種單體酚包括11 種酚酸和15 種黃酮。從單體酚類型來看，4 個時期游離態酚酸總含量分別是同時期酯化態酚酸總含量的3.18 倍（采前63 d）、11.57 倍（采前49 d）、4.74 倍（采前21 d）、4.68 倍（成熟期），是同時期結合態酚酸總含量的0.98 倍（采前63 d）、3. 73 倍（采前49 d）、3. 39 倍（采前21 d）、0.57 倍（成熟期）。這表明在發育過程里核桃仁中酚酸類單體酚大多以游離形態存在。在游離態酚酸中，未成熟期的鞣花酸（采前63 d，153.95 μg／g）和阿魏酸（采前63 d，65. 56 μg／g）含量相對居多。在成熟期中沒食子酸含量最多（80.19 μg／g）。含量較多的鞣花酸和阿魏酸呈現隨成熟度增加而減少的趨勢，二者成熟期含量相比于未成熟早期含量降幅分別為81.41%和88.87%，沒食子酸游離態含量隨成熟度增加而增加，成熟期含量是未成熟早期的2.29 倍。在結合態酚酸中：未成熟早期的原兒茶酸（采前63 d，22.17 μg／g）、沒食子酸（采前63 d，77.55 μg／g）、鞣花酸（采前63 d，164.05 μg／g）含量較多，而其余酚酸類單體酚在未成熟期的含量均小于10 μg／g。在成熟期中鞣花酸、沒食子酸結合態含量較多，兩者含量均超過40 μg／g。值得注意的是芥子酸的結合態含量在整個時期都未被檢測出。在酯化態酚酸中：在未成熟期內只有采前63 d 的鞣花酸（67.64 μg／g）含量超過10 μg／g，同時該時期（采前63 d）酯化態總酚酸含量也只有85.09 μg／g。在成熟期內對羥基苯甲酸含量（14.57 μg／g）較多，其余酯化態酚酸類單體酚含量均5 μg／g以下。整個發育過程中鞣花酸、咖啡酸、原兒茶酸、綠原酸等酚酸的3種形態含量變化趨勢都為下降型。

圖2 游離態酚含量成熟度的變化

圖3 酯化態酚含量隨成熟度的變化

圖4 結合態酚含量隨成熟度的變化

黃酮類單體酚中仍然多以游離態存在。未成熟期的游離態兒茶素（采前63 d，105.18 μg／g）、二氫槲皮素（采前63 d，159.88 μg／g）、表兒茶素（采前49 d，41.28 μg／g）含量較多，超過同時期其余游離態黃酮類單體酚含量9 倍以上。而成熟期中游離態黃酮含量都很低，鑒定出的15 種游離態黃酮類單體酚含量均小于6 μg／g。酯化態、結合態黃酮類單體酚在整個時期內含量都很低，未成熟期里只有采前63 d時兒茶素（12.35 μg／g）和二氫槲皮素（6.80 μg／g）的結合態含量略多，其余黃酮類單體酚的酯化態和結合態含量均在3 μg／g以下。成熟期中只有二氫槲皮素酯化態含量大于5 μg／g。從整體來看，3 種形態中含量均最多的兒茶素呈現隨成熟度增加而減少的趨勢，平均降幅超過80%。含量較多的二氫槲皮素的游離態、結合態含量都隨成熟度增加而減少，降幅分別為96.42%和86.51%，其酯化態含量隨成熟增加而上升，成熟期（5.09 μg／g）含量是未成熟早期（采前63 d，2.47 μg／g）含量的2.06 倍。

鞣花酸具有抗氧化，與蛋白質絡合，以及收斂作用，在食品、醫藥、工業上有著及其廣泛的應用［28，29］。鞣花酸在前人有關核桃仁研究中被認為是含量最豐富的單體酚［30，31］。本研究發現成熟期‘寒豐’種仁中鞣花酸的含量為189.48 μg／g，遠高于‘Chandler’（24.70 μg／g）、‘Howard’（12.40 μg／g）和‘Hartley’（6.90 μg／g）品種中鞣花酸的含量［32］，值得注意的是，‘寒豐’采前63 d 的鞣花酸含量更高，甚至達到了成熟期的2 倍以上。此外，兒茶素、二氫槲皮素，阿魏酸等也被發現在采前63 d 含量達到最高值，尤其是兒茶素在采前63 d含量達118.72 μg／g，為成熟期含量的30 倍以上。同時，表兒茶素等單體酚含量的最高值也出現在未成熟期，這表明未成熟期核桃在一些特定單體酚上的開發價值甚至要高于成熟期。另一方面，沒食子酸已被作為天然抗氧化劑來延長食品的保質期［33］，而以沒食子酸為代表的一些單體酚含量最高值出現在核桃仁成熟期。結果表明針對核桃不同的開發用途，特別是對某一單體酚的開發，需要選擇適宜的采收期。

2.3.2 不同形態單體酚含量與總酚含量以及抗氧化活性相關性

采用Pearson相關系數來探究核桃仁發育過程中不同形態單體酚對各形態酚抗氧化活性的貢獻（表2）。結果表明隨著果實成熟發育，含量較多的鞣花酸、阿魏酸、兒茶素的游離態含量變化與游離態總酚含量、抗氧化活性變化相關性為強相關，平均相關系數分別為0.63、0.61、0.69。說明這些游離態單體酚對核桃仁發育中游離態總酚抗氧化活性起主要貢獻。同樣，酯化態、結合態單體酚中含量豐富的鞣花酸、沒食子酸、兒茶素含量變化與2 種形態總酚含量、抗氧化活性變化相關性也為強相關，相關系數均超過0.6。這些結果表明核桃仁在發育過程中所含酚類物質抗氧化活性的強弱不僅受成熟度影響，也與存在形態有關。

表2 3種形態單體酚與各形態酚抗氧化活性、總酚含量的相關性分析

3 結論

核桃仁在發育成熟過程中3 種形態總酚含量呈現隨成熟度增加而降低的趨勢，酚含量均在未成熟早期最大，游離態始終是核桃仁動態發育過程中酚類主要形態。同時，3 種形態酚抗氧化活性也在未成熟早期有最大值，游離態是核桃仁發育過程中提供抗氧化活性的酚類物質主要形態，并肯定了結合態酚抗氧化活性在成熟期時對酚整體抗氧化能力的作用。將整個時期3 種形態單體酚含量與各形態總酚含量、抗氧化活性進行相關性分析，發現核桃仁中單體酚含量的變化不僅與成熟有關也受酚存在形態影響。本研究從核桃發育過程出發，深入探究3 種形態總酚、單體酚以及抗氧化活性受成熟度的影響，對指導核桃原料采收時間，評估核桃營養價值，優化相關產業供應鏈等相關研究提供借鑒。