產黃曲霉毒素真菌雙重熒光定量PCR檢測技術的建立與應用

陳冠果，李 可，陸金虎，金晨晨，王 龑，帥江冰，鮑維琪，程昌勇，宋厚輝，張曉峰

（浙江農林大學動物科技學院·動物醫學院；浙江省畜禽綠色生態健康養殖應用技術研究重點實驗室；動物健康互聯網檢測技術浙江省工程研究中心；浙江省動物醫學與健康管理國際科技合作基地；中澳動物健康大數據分析聯合實驗室1，杭州 311300）

（浙江省檢驗檢疫科學技術研究院2，杭州 310016）

（浙江工業大學食品科學與工程學院3，杭州 310014）

常見的產毒真菌主要包括曲霉屬、青霉屬和鐮刀菌屬等，它們能夠在合適的環境條件下產生黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等有毒次級代謝產物［1，2］。真菌毒素主要產生致畸作用、致癌作用、肝細胞毒性和免疫抑制等毒性作用，給人和動物的健康帶來不可逆的損害［3］。此外，多數真菌毒素性質十分穩定，即使在酸性和高溫環境下也很難分解，一旦受到真菌毒素污染很難徹底去除［4］。據報道，全世界每年高達1／4 的糧油會被真菌毒素污染［5］，我國每年因真菌毒素污染而損失的糧食最高可達7%［6］。

黃曲霉毒素（aflatoxins）是一大類由二呋喃香豆素（difuranocoum）衍生物組成的結構相似化合物的總稱，主要由產毒黃曲霉菌（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）和集蜂曲霉（Aspergillus nonius）等真菌產生，是已知致癌力最強的天然物質［7］。該毒素多存在于保存不當的花生、麥類和玉米等農產品及其加工制品、調味品、食用油和牛奶中，對人和動物的食品安全帶來了嚴重隱患。世界衛生組織（WHO）早在1993 年就將黃曲霉毒素認定為Ⅰ類致癌物［8］。在諸多黃曲霉毒素中，以黃曲霉毒素B1（AFB1）毒性和致癌性最強［9］。目前檢測真菌毒素的方法主要有高效液相色譜法（HPLC）［10］、液相色譜－串聯質譜法（LC －MS）［11，12］、氣相色譜（GC）［13］、膠體金免疫層析法（GICT）［14］、時間分辨熒光免疫分析法（TRFIA）［15］、酶聯免疫吸附法（ELISA）［16］和電化學傳感器法［17］等。色譜法靈敏度較高，但操作復雜且檢測周期長，無法滿足日常檢測實時、快速、精確的監測要求，膠體金免疫層析法和ELISA方法簡單快捷，但檢測結果易受環境因素影響，時間分辨熒光免疫分析法靈敏度高，穩定性好，但該方法中使用的螯合劑易對環境和檢測人員帶來危害，材料使用壽命也有待延長，電化學傳感器靈敏度高且操作簡單，但該技術對傳感器的選擇及抗原抗體的穩定性有著較高要求。Alshannaq 等［18］研究發現，相較于檢測真菌毒素，直接檢測產毒真菌可以在一定程度上降低對人和動物的感染風險，起到早期預警的作用，這將有助于食品生產人員及早采取相應措施，預防和控制產毒真菌的生長。熒光定量PCR是目前使用最多的分子生物學檢測方法，可以特異性地從基因的角度來檢測多種病原體［4，19－21］，具有檢測周期短、特異性好、靈敏度高等優點［22］。

我國目前對于產黃曲霉毒素真菌的分子生物學檢測方法多集中于檢測其總調節基因——aflR 基因［3，4，23］，而忽略了nor －1 基因這一負責合成AFB1前體物質的關鍵基因［24］。研究發現，在不產毒黃曲霉菌的基因組中，aflR 和nor －1 等基因缺失情況最多，且會缺失2 個基因中的至少其中1 個［25］，表明這2個基因與黃曲霉毒素的產生有著密不可分的關系。然而，國內關于同時檢測產黃曲霉毒素真菌aflR 基因和nor－1 基因的熒光定量PCR（quantitative PCR，qPCR）方法目前還未見報道。本研究擬通過建立一種雙重熒光定量PCR方法來同時檢測產黃曲霉毒素真菌基因簇中的aflR基因和nor －1 基因，以期能夠提高檢測體系的檢測效率和準確性，并為農產品及食品中常見產黃曲霉毒素真菌提供一種新型監測手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 真菌菌株

寄生曲霉CGMCC30124 由拱北海關技術中心饋贈，赭曲霉CGMCC3. 4520、黑曲霉CGMCC3.3927 源自河南省工業微生物菌種工程技術研究中心，產毒黃曲霉菌NRRL3357、炭黑曲霉ITEM 5010由浙江工業大學饋贈。鐮刀菌F －21 由本實驗室分離保存。

1.1.2 主要試劑

真菌DNA提取試劑盒QIAamp DNA Mini Kit；熒光定量PCR試劑Premix EX TaqTM（探針法）；黃曲霉毒素B1ELISA 試劑盒；焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）處理水；1xTris－EDTA緩沖液。

1.2 儀器與設備

LightCycler 480 Ⅱ實時熒光定量PCR 儀，Nanophotometer 超微量分光光度計，15PK 臺式離心機，Mini－7K掌上離心機。

1.3 引物的設計與合成

根據NCBI－GenBank中已公布的黃曲霉毒素產毒基因aflR和nor －1 的基因保守序列，使用Primer 3分別各設計2 對特異性引物和與之對應的探針（表1）。以L32577.1 基因序列和AY510451.1 基因序列設計質粒標準品pUC57 －aflR（基因合成位點：891 －1100）和pUC57 －nor1（基因合成位點：1 －200），根據公式：拷貝數＝（質粒濃度×阿伏伽德羅常數×10－9）／ （660 ×基因片段堿基數）計算出pUC57 －aflR和pUC57 －nor1 的初始拷貝量分別為1.5 ×1010copies／μL和1.3 ×1010copies／μL。

表1 引物和探針序列

1.4 引物探針有效性篩選

以產毒黃曲霉菌NRRL3357 基因組DNA 為模板，進行單重熒光定量PCR 擴增，分別驗證aflR 和nor1 兩對引物探針的有效性，每一對引物探針均設置3 次重復。熒光定量PCR反應條件：95 ℃預變性60 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40 個循環。

1.5 反應條件的優化

本方法以單重熒光定量PCR 實驗為基礎，以pUC57 －aflR和pUC57 －nor1 質粒為擴增模板，分別通過矩陣法優化2 對引物和探針的濃度，以此確定一個最佳雙重反應體系。

1.6 標準曲線的建立

以優化后的反應條件為基礎，將pUC57 －aflR和pUC57 －nor1 標準質粒按10 倍倍比稀釋至理論濃度為1 ×108～1 ×103copies／μL共6 個梯度，以它們為模板進行雙重熒光定量PCR，分別獲得反應完成時的實際拷貝數和Ct值。以得到的Ct值為y軸，以相對應的標準質粒濃度的對數值為x 軸，使用Graph-Pad Prism 8.0 軟件計算和繪制出它們的標準曲線，同時計算出二者的擴增效率。

1.7 特異性實驗

使用真菌DNA 提取試劑盒提取產毒黃曲霉菌NRRL3357、寄生曲霉CGMCC30124、赭曲霉CGMCC3. 4520、黑曲霉CGMCC3. 3927、炭黑曲霉ITEM5010、鐮刀菌F－21 的基因組DNA后，以各真菌的DNA 為模板，以ddH2O 為陰性對照，檢測其特異性。

1.8 靈敏度及重復性實驗

將pUC57 －aflR 和pUC57 －nor1 標準質粒進行連續10 倍梯度稀釋，獲得理論濃度1 ×105～1 ×101copies／μL 共5 個系列，每組濃度重復10 次，用已建立的雙重熒光定量PCR體系評估該方法的靈敏度。

選取濃度為1 ×106～1 ×102copies／μL 的標準質粒混合物作為模板分別進行10 次組內重復實驗，并選擇不同時間點再進行3 次組間重復實驗，計算Ct值的標準差和變異系數，檢測其重復性。

1.9 實際樣品的檢測

本研究共檢測80 份來自全國不同產區不同批次的玉米、黃豆和花生及其制品，參考真菌DNA 提取試劑盒說明書對其進行總DNA 提取后，按照已建立的雙重熒光定量PCR方法進行檢測，選擇aflR 和nor－1 兩種基因檢測Ct值均≤35 的樣品DNA判定為陽性，同時用ELISA 試劑盒，參照現行國標［26］中的前處理方法及試劑盒說明書對這些樣品進行檢測與驗證，選擇樣品檢測AFB1濃度≥0.15 μg／kg 的判定為陽性。

2 結果與分析

2.1 引物探針有效性篩選

擴增曲線結果顯示，在擴增aflR基因時，aflR－1引物／探針和aflR－2 引物／探針的Ct平均值分別為26.79 和26.81，較為接近，但aflR －2 引物／探針的熒光強度略高于aflR －1 引物／探針（圖1a）。在擴增nor － 1 基因時，nor1 － 1 引物／探針和nor1 － 2引物／探針的Ct平均值也較接近，分別為27. 67和27.61，但nor1 － 2 引物／探針整體的熒光強度較nor1 －1引物／探針更高（圖1b）。以上實驗平行之間重復性好，且陰性對照均無擴增，綜合Ct值和熒光強度比較，選用aflR－2 和nor1 －2 2 組引物／探針來進行后續實驗。

圖1 不同引物探針的熒光定量PCR擴增結果

2.2 反應條件的優化

經過矩陣法對反應體系和條件的優化后，確定了雙重熒光定量PCR反應總體系見表2。

表2 雙重熒光定量PCR反應總體系

2.3 標準曲線的建立

以反應結束時得到的Ct值為y 軸，以相對應的標準質粒濃度的對數值為x軸，經計算，pUC57 －aflR的線性關系方程為Y ＝－3.301X ＋38.97，相關系數R2＝0.996 9，擴增效率為100.89%。pUC57 －nor1的線性關系方程為Y ＝－3.324X ＋39.71，相關系數R2＝0.999 8，擴增效率為99.91%。pUC57 －aflR 和pUC57 －nor1 的線性回歸方程的斜率均在3.1 ～3.5范圍內，相關系數R2均大于0. 99，擴增效率位于90% ～110%區間內，且pUC57 － aflR 和pUC57 －nor1 各組質粒濃度所對應的Ct值的標準偏差均小于0.1，表明本研究所建立的方法具有很好的重復性和擴增效率，且反應的Ct值與相對應質粒濃度對數值之間有良好的線性關系。

2.4 特異性考察

通過對產毒黃曲霉菌、寄生曲霉、赭曲霉、黑曲霉、炭黑曲霉、鐮刀菌和陰性對照進行擴增，結果顯示只有產黃曲霉毒素的黃曲霉菌和寄生曲霉DNA擴增結果為陽性，而其他樣本及陰性對照對2 個基因均未擴增出陽性曲線（圖2），表明本研究所建立的雙重熒光定量PCR能夠對合成黃曲霉毒素的總調節基因aflR基因及其關鍵產毒基因nor－1 基因表現出良好的特異性擴增，能夠有效的鑒定及篩選出樣品中的產毒黃曲霉菌。

圖2 雙重熒光定量PCR特異性實驗

2.5 靈敏度及重復性考察

靈敏度實驗結果顯示（表3），當質粒濃度為10 copies／μL時，pUC57 －aflR在組內10 次重復中僅檢出4 次陽性，而pUC57 －nor1 則均未檢出陽性，故該體系對pUC57 －aflR 和pUC57 －nor1 這2 種標準質粒的最低檢測濃度均為1 ×102copies／μL。

表3 雙重熒光定量PCR靈敏度實驗

重復性實驗標準差計算結果顯示，pUC57 －aflR的批內變異系數為0. 10% ～0. 39%，pUC57 － nor1的批內變異系數為0.07% ～0.56%。pUC57 －aflR批間變異系數為0.15% ～2.02%，pUC57 －nor1 批間變異系數為0.36% ～0.61%，3 次不同批次實驗的檢測結果無顯著性差異，表明該方法重復性較好。

2.6 實際樣品檢測

檢測結果顯示，16 份玉米樣品中雙重熒光定量PCR方法共檢出2 份陽性樣品（aflR／nor －1 基因Ct值分別為29.88／30.04、33.60／33.67），ELISA 方法檢測出了1 份陽性樣品（樣品液檢出質量濃度為0.51 μg／kg）。32 份生花生中雙重熒光定量PCR方法共檢出5 份陽性樣品（aflR／nor－1 基因Ct值分別為34.34／34. 08、34.56／34.03、24. 1／24. 41、29.90／29.97、34.29／34.00），ELISA方法檢測出4 份陽性樣品（樣品液檢出濃度分別為0. 22、0. 20、1. 38、0. 7 μg／kg）。20 份黃豆樣品2 種檢測方法檢測結果一致，均為陰性。12 份花生加工制品2 種檢測方法均檢出2 份陽性樣品，結果一致（aflR／nor －1 基因Ct值分別為30.9／31.18、31.35／32.05，樣品液檢出濃度分別為0.88、0.28 μg／kg）。其中，共有1 份玉米樣品和1 份生花生樣品ELISA檢測結果為陰性而雙重熒光定量PCR檢測結果為陽性（aflR／nor －1 基因Ct值分別為33.60／33.67 和34.29／34.00）。因此，本實驗所建立的雙重熒光PCR方法共檢出9 份陽性樣品，而ELISA試劑盒共檢出7 份陽性樣品。

將雙重熒光PCR方法檢出而ELISA方法未檢出的2 份疑似陽性樣品，于霉菌最適生長溫度28 ℃培養96 h 后再次用ELISA 方法進行檢測，結果顯示2份樣品的檢測結果均為陽性（樣品液檢出濃度分別為0.45、0.21 μg／kg）。出現此類情況，推測是由于食品樣品在儲藏早期，產黃曲霉毒素真菌以生長為主，產黃曲霉毒素很少或不產毒，故ELISA 無法檢出，出現了“假陰性”的情況，這也進一步表明本研究所建立的方法相較于ELISA 方法具有更高的靈敏度，且能夠及時地發現和預警食品和農作物中潛在的產黃曲霉毒素真菌。

此外，本實驗所建立的方法共檢出9 份陽性樣品，其中花生及其制品的陽性檢出率約為16%，高于黃豆及玉米的陽性檢出率（分別為0%和12.5%），推測是由于產黃曲霉毒素真菌對油性作物的易感性更高［27，28］，此外，在2015—2018 年我國出口歐洲國家的食品及飼料中，花生樣品檢測超標的案件就有200 余起，占超標案例中的93%［29］。

3 討論

黃曲霉毒素生物合成基因簇全長約80 kb［30］，這些生物合成相關結構基因成簇地排列在同一條染色體上，且這些基因在染色體上的位置與其在合成表達產物時與催化反應的先后順序一致［31］。作為合成黃曲霉毒素最關鍵的調節基因，aflR 基因能夠調節黃曲霉毒素基因簇上大部分結構基因的轉錄活性，同時又可編碼一個分子質量為47 ku 具有鋅指結構的DNA 結合蛋白（aflR）［32，33］。nor －1 基因（也叫aflD基因）負責編碼一個分子質量為27 ku 的酶，在該酶的催化下，合成黃曲霉毒素的前體物質諾素羅瑞尼克酸（norsolorinic acid，NA）轉化為奧佛蘭提素（averantin）［34］。此外，Mayer 等通過檢測小麥中nor－1 mRNA與AFB1含量的關系發現：在AFB1尚未檢測出時就已經檢測到了產毒基因nor －1［24］，這也使得從分子生物學角度監測早期食品及農作物中潛在的產黃曲霉毒素真菌成為可能。

目前我國在真菌檢測方面的分子生物學技術主要有PCR 方法，DNA 條碼技術，DNA 指紋技術等。李慧等的多重PCR 雖然可以同時檢出多種產毒真菌，但該方法需要瓊脂糖凝膠電泳，實驗過程耗時較長［23］。張慶等的多重實時熒光PCR 技術可以同時檢出多種產毒真菌，但該方法整體的靈敏度和擴增效率還有待提高［4］。在DNA 條碼技術鑒定真菌的應用上，Geiser等曾通過β －tubulin 基因和鈣調蛋白基因來完成對曲霉屬真菌的相關鑒定，但該技術需要建立一套完整的數據庫，在真菌方面的檢測目前還存在一定局限性［35］。孫長坡等［36］基于DNA指紋技術中的限制性片段長度多態性技術來完成對產黃曲霉毒素真菌的快速檢測，但是該技術的重復性和靈敏度都有待提高，且操作相對費時費力。針對產黃曲霉毒素真菌的PCR檢測方法目前多偏向于多種真菌共檢［4，23，37］，這種方法耗時短，能夠同時檢測2種及2 種以上的真菌，但檢測的靈敏度不高，且容易出現交叉污染。本研究分別針對aflR 基因和nor －1基因各設計了2對特異性引物和探針，通過引物探針有效性實驗篩選出了aflR－2 和nor1 －2 2 組引物／探針，反應體系經優化確定aflR －2 引物和探針終濃度分別為0.3 μmol／L和0.2 μmol／L，nor1 －2 引物和探針終濃度分別為0.2 μmol／L 和0.3 μmol／L，建立了產黃曲霉毒素真菌雙重熒光定量PCR 檢測方法，本方法的最低檢測限均低至1 ×102copies／μL，重復性檢驗批內變異系數＜1%，批間變異系數＜3%，表明該檢測方法靈敏度高且重復性好。同時，在實際樣品的檢測過程中，本研究所建立的檢測方法共檢出了9 份陽性樣品而ELISA試劑盒只檢測出了7 份陽性，表明本研究所建立的雙重熒光定量PCR 方法相較于ELISA方法更為準確高效且靈敏度更高。

4 結論

本研究建立的雙重熒光定量PCR能夠同時檢測aflR基因和nor －1 基因，在降低核酸檢測過程中假陰性概率的同時，提高了反應體系的敏感性和檢測效率。經過對比與驗證，本研究所建立的雙重熒光PCR方法能夠準確地識別出待檢樣品中潛在的產黃曲霉毒素真菌，且檢出率高于國家標準中推薦的ELISA檢測方法。因此，該方法可為實際食品樣品儲藏過程中產黃曲霉毒素真菌的診斷和早期監測提供一種快速、敏感、準確的檢測手段。