酸性調控對大豆分離蛋白纖維功能性質的影響

高喧翔，梅馨瀾，朱澤丹，陳鴻杰，樊繼開，楊素華，劉玲玲，班兆軍

（浙江科技學院生物與化學工程學院；浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室；浙江省農業生物資源生化制造協同創新中心，杭州 310023）

蛋白質自組裝纖維已經吸引了各研究領域的關注，如納米技術、食品、電子、醫藥和軟物質科學［1］。蛋白纖維的形成一般是在酸性環境下進行熱處理而引起的。在加熱過程中，蛋白質會展開、水解，然后自我組裝成纖維狀聚集體［2］，如乳清蛋白［3］、溶菌酶［4］、β－乳球蛋白［5］等均可在一定條件下，形成直徑約為2 ～8 nm，長度為20 ～30 μm的蛋白纖維。

在食品科學領域，蛋白纖維化主要作為改善蛋白功能性質的一種方法［6］。蛋白質經纖維化改變后，表面會呈現出多種反應性官能團，這使得它們被賦予新的功能特性。蛋白纖維會導致表觀黏度的顯著增加，形成黏性黏彈性界面，從而帶來高泡沫和乳液穩定性［7］。在極低濃度下，纖維蛋白可以產生冷凝凝膠，這被歸因于空間填充網絡的形成［8］。除此之外，蛋白纖維還具有增強聚合物膜，作為輸送載體以及在制造生物傳感器和生物吸附劑（主要作為支架）的應用［9］。然而，蛋白質纖維化進程是極其復雜的，受諸多因素影響，如體系溫度、鹽離子、不良溶劑等，人們對蛋白纖維的調控手段及穩定機理還知之甚少。

酸誘導劑會影響自組裝纖維化進程，不同強度的酸溶劑電解能力不同，由此誘導的蛋白纖維中氫鍵濃度也不同。因此，為了更清楚地認識蛋白質纖維化組裝規律，本研究選擇用醋酸和鹽酸對SPI進行纖維化處理，然后探究不同SPI 自組裝纖維的結構、乳化特性、凝膠特性及成膜性質，以實現蛋白纖維的可控化制備。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

根據堿溶酸沉法實驗室自制大豆分離蛋白，蛋白質質量分數為（94.30 ±1.54）%；冰醋酸、鹽酸等均為分析純。

1.2 儀器與設備

HCJ－4G磁力攪拌水浴鍋，Zetasizer Nano 納米粒度儀，Mastersizer 3000 粒度分布儀，Multimode SPM原子力顯微鏡，Chirascan 圓二色譜儀，日立F －4500熒光分光光度計，TA－XT2i質構儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 SPI纖維化溶液制備與性質表征

用一定濃度的HCl溶液和醋酸溶液將SPI 粉末溶解，調節pH至2.0，配制成質量濃度為60 mg／mL溶液；放入水浴鍋加熱5 h，期間每隔15 min進行1 次驗調，得到由鹽酸誘導形成的SPI 纖維（H －SPI）和由醋酸誘導形成的SPI纖維（C－SPI）；另取SPI粉末溶于PBS溶液（pH ＝7.0，5 mmol／L）配制成質量濃度為60 mg／mL的蛋白溶液，放入水浴鍋加熱5 h，作為對照樣品（N－SPI）。

二級結構測定：使用圓二色譜儀在190 ～260 nm之間進行掃描，測量質量濃度為0.2 mg／mL，掃描速度20 nm／min，帶寬1 nm。二級結構含量的分析和計算根據在線網站http：／ ／ dichroweb. cryst. bbk. ac. uk獲得。

粒度測定：采用馬爾文粒度分析儀測定LYZ 的平均粒徑和粒度分布。將A －LYZ 溶液用醋酸溶液（pH ＝2.0）稀釋至0.5 mg／mL。O － LYZ 溶液用0.01mol／L的PBS緩沖溶液（pH ＝7.0）進行稀釋。

微觀形態：LYZ 經過纖維化前后的顆粒形貌通過原子力顯微鏡（AFM）觀察得到。A －LYZ 溶液用醋酸溶液（pH ＝2.0）稀釋至25 μg／mL，O－LYZ溶液用去離子水稀釋。取20 μL稀釋后的溶液滴加在新鮮剝離的云母片表面，等待自然風干。在輕敲模式下進行測量，AFM觀測到的圖像用NanoScope Analysis 1.9 軟件進行圖像處理和分析。

硫黃素（ThT）熒光分析：實驗方法參考朱連昌［7］。使用10 mmol／L、pH ＝7.0 的磷酸鹽緩沖溶配置質量濃度為0.016 mg／mL 的ThT 工作液。取5 mL工作液與30 μL樣品混合均勻，測定混合液熒光強度。測定條件設為激發波長460 nm，發射波長490 nm，狹縫間隙5 nm，電壓700 mV，掃描范圍為470 ～600 nm。

1.3.2 凝膠的制備與性質測定

將制備N－SPI、H －SPI、C －SPI 溶液中的蛋白質量濃度提高至100 mg／mL，并將樣品于4 ℃靜置24 h，得到N－SPI、H－SPI、C－SPI凝膠。

采用質構儀測定蛋白凝膠的凝膠硬度。在室溫下，選取P5 探頭（直徑5.0 mm），輸入測前速度為2.0 mm／s，測中速度為1.0 mm／s，測后速度為3.0 mm／s，觸變力為3.0 g，壓縮的變形量為50%。

1.3.3 乳液的制備及性質測定

向N－SPI、H －SPI、C －SPI 溶液中緩慢地加入不同油相比的食用油（油體積分數φ ＝0.2、0.4、0.6），用均質機在10 000 r／min轉速下均質3 min，得到N－SPI、H－SPI、C－SPI乳液。

乳液的微觀形態采用光學顯微鏡觀察。乳液的粒徑利用Mastersizer 3000 粒度分布儀測定。分散劑為去離子水，乳液的相對折射率為1.470，分散劑折射率為1.330。

脂肪上浮率（CI）：取10 mL新制乳液于小瓶中，在室溫下放置，并記錄不同時間下層清液的高度（HS）和總高度（HT）。

1.3.4 膜的制備及性質測定

分別取10 mL N －SPI、H －SPI、C －SPI溶液，各加入0.2 g甘油，攪拌均勻后采用流延法于聚四氟乙烯平皿中制備薄膜，室溫下干燥后揭膜，置于RH＝40%干燥器保存待用。膜的厚度選取薄膜的5 個點進行測量，計算平均值，精確至0.001 mm。

機械性能：薄膜機械性能主要測定抗拉強度（TS）和斷裂伸長率（E）。將薄膜裁剪成2 cm×6 cm的規格，用夾具固定進行測量，初始夾距30 mm，拉伸速度50 mm／min［10］。

水蒸氣透過率：水蒸氣透過率（WVP）和水溶性（WS）的測定見文獻［11］。干燥器內放入BaCl2飽和溶液使其濕度保持在90%。選擇敞口玻璃容器放入烘干至恒重的CaCl2并將裁剪的薄膜覆蓋在玻璃容器表面，用礦脂密封后置于干燥器中，每隔一段時間稱量玻璃容器的質量，并按式（2）計算薄膜的WVP。

式中：WVP為濕系數／g·mm／（m·d·Pa）；Δm為t時間內質量增量／g；X為膜的厚度／mm；A為透濕杯的有效測定面積／m2；t為時間間隔／h。

水溶性：將薄膜裁剪成2 cm ×2 cm 的規格，在105 ℃下干燥至恒重m1。加入50 mL去離子水在室溫下溶解24 h，將水倒掉，干燥至恒重為m2，根據質量變化計算薄膜的水溶性。

式中：m1為第1 次干燥至恒重時薄膜的質量／g；m2為第2 次干燥至恒重時薄膜的質量／g。

1.3.5 數據統計分析

使用Origin 2020b軟件、Excel軟件和SPSS對數據進行分析處理。

2 結果與討論

2.1 蛋白纖維化

SPI纖維化反應前后的粒度分布和平均粒徑如圖1 所示。原始SPI（N－SPI）的粒徑成單峰分布，平均粒徑約為（24 ±1.5）nm，與之前的報道相符［12］。經鹽酸誘導的蛋白溶液（H －SPI）體積分布較N －SPI粒徑顯著增大，且呈雙峰分布，峰值分別在（35 ±5.3）、（719.3 ±37.9）nm 處。說明鹽酸誘導的SPI在85 ℃熱處理過程中發生聚集而形成較大顆粒。相較于H－SPI，經醋酸誘導的蛋白溶液（C －SPI）粒徑進一步增大，平均粒徑增大至（1 431. 6 ±56. 5）nm，這是由于蛋白質單體在疏水作用和靜電斥力作用下發生纖維化轉變的結果［13］。

圖1 3 種蛋白溶液的粒徑分布圖和平均粒徑

SPI經纖維化處理后的微觀形態如圖2 所示。N－SPI為20 ～240 nm 的球形顆粒，分散性良好，與粒徑分布結果一致。H－SPI外觀呈長而細，無分支，部分彎曲狀態，長度為450 ～920 nm。在Xiang等［14］的研究中也發現了大豆分離蛋白進行纖維化處理后出現了蠕蟲樣的原纖維以扭曲的形式存在。C －SPI呈蠕蟲樣的卷曲狀，長度約為700 ～1 500 nm。鹽酸和醋酸誘導出不同淀粉樣纖維的原因可能與兩者氫離子濃度不同相關，同一pH 下，醋酸溶液電離出的氫離子濃度更高，蛋白纖維中氫鍵濃度也更高，其誘導形成的蛋白纖維更加綿長。

圖2 原子力顯微鏡2D和3D成像圖

蛋白質纖維化往往伴隨分子構象的轉變，特別是β －折疊結構的形成［15］。ThT能平行插入β －折疊結構并與其結合，導致蛋白最大熒光強度顯著增大，可利用該原理檢測蛋白質纖維化反應動力學，并以此判斷蛋白纖維形成［16］。如圖3a 所示，N － SPI具有較低的ThT 熒光強度（～1 932）。隨著纖維化時間的延長，H －SPI 的ThT 最大熒光強度由1 932增加至3 853，C－SPI增加至4 711，至5 h 以后保持平穩，這說明經纖維化處理，大豆蛋白β －折疊結構總量大大增加且纖維化的最優時間為5 h。之后，進一步利用CD 判斷SPI 經纖維化處理前后二級結構的變化情況，如圖3b所示，N－SPI在208 nm處具有明顯的負平均殘基橢圓率，表明原始SPI以α －螺旋為主。SPI經鹽酸纖維化處理后，波長從208 nm 移到203 nm，同時最大負平均殘基橢圓率增加。而SPI經醋酸處理后的最大負平均殘基橢圓率進一步增大，表明形成了更多的β －折疊結構。由BeStSel 軟件計算可知，H－SPI和C－SPI的β －折疊質量分數由34.50%分別提高到40.80%和42.40%。

圖3 蛋白在熱處理過程中的Th T最大熒光強度和蛋白溶液的遠紫外光譜

2.2 凝膠特性

蛋白纖維化最明顯的特征就是β －折疊結構明顯增多，而富含β－折疊結構的材料通常具有獨特的高比表面積和機械強度，從而表現出較好的膠凝和成膜能力［17］。如圖4 所示，N －SPI、H －SPI、C －SPI的凝膠硬度分別為181.94、234.64、399.31 g。相比之下，顆粒型蛋白凝膠的硬度遠遠低于纖維型蛋白凝膠，而由醋酸調配的纖維型蛋白凝膠的硬度更是高于由鹽酸調配的纖維型蛋白凝膠。凝膠的持水能力則體現了蛋白質分子與水分子間的氫鍵相互作用，通常兩者作用力越強，蛋白的持水能力越強［18］。由圖4 可知C－SPI型凝膠蛋白分子與水的結合能力最強，這說明醋酸誘導的蛋白纖維化表面擁有更多的氫鍵位點。

圖4 3 種蛋白凝膠的凝膠硬度和持水能力

2.3 成膜性質

3 種蛋白的成膜能力則是通過測定其膜的機械性能和屏障性能表示。TS 和E 分別反映了薄膜的變形抗力和韌性［19］。如表1 所示，纖維化處理對N－SPI薄膜的TS和E影響較為顯著，尤其是C－SPI的E值，比N－SPI提高7.1 倍。主要的原因是在酸熱處理過程中，蛋白質的β－折疊結構及氫鍵濃度的增加，由此形成堅固致密的網狀結構，從而得到具有一定機械強度和柔韌性兼具的薄膜［20］。蛋白薄膜的WVP和WS則反應了蛋白薄膜的屏障性能，如表1所示。與N－SPI 薄膜相比，纖維化薄膜的WVP 和WS均有明顯的下降，說明纖維化后薄膜擁有更強的阻水性能，這在一定程度上反映了纖維化薄膜網狀結構的致密性，纖維化薄膜更能有效地隔絕水分［21］。

表1 薄膜的機械性能、水蒸氣透過率和水溶性

2.4 乳化性質

纖維化是蛋白質結構展開再折疊的過程，該過程結束后，蛋白質的柔順性會發生巨大改變［22］。據報道，蛋白質的柔順性與其乳化性密切相關［23］。以C－SPI和H －SPI與N －SPI為乳化穩定劑，制備水包油乳液，并對比研究三者的乳化性質。在c和φ相同的條件下，蛋白的乳化活性可以由乳液平均粒徑反映。由圖5 所示，而相同的濃度和油相比的條件下，顆粒型蛋白乳液平均粒徑遠大于纖維型蛋白乳液平均粒徑，其中由醋酸調配的纖維型蛋白乳液的平均粒徑要低于由鹽酸調配的纖維型蛋白乳液。當油相比增大時，乳液的粒徑不斷增大。這是因為油滴濃度的增大，穩定乳化界面的乳化劑越少，導致油滴間產生相互作用的概率增大，在疏水相互作用下形成粒徑更大的油滴［24］。圖6 為該場合下，不同油相比的3 種蛋白乳液稀釋后的顯微鏡照片，C －SPI乳液的粒徑隨著油滴濃度的增大，粒徑增大幅度較小，這可能與C－SPI的結構柔順性有關。蛋白柔順性越高，吸附在油水界面的穩定性越高，那么其穩定乳液界面的能力就越強。

圖5 3 種蛋白乳液在不同油相比中的平均粒徑（c ＝1 mg／100 mL）

乳液油滴之間互相絮凝、結合產生新的更大的油滴聚合體，因為油和水密度的不同，會迅速形成分層，也就是脂肪上浮現象［25］。圖7 是質量濃度為1 mg／100 mL的N－SPI、H－SPI、C －SPI型乳液在室溫下靜置14 d過程中脂肪上浮的情況。3 種乳液均在3 d內達到最大脂肪上浮率，且其脂肪上浮率隨φ的增大而減小，纖維化乳液的脂肪上浮率略小于顆粒型乳液，而C －SPI 乳液的穩定性略優于H －SPI乳液。造成以上差異的原因可能是纖維化蛋白富含β－折疊結構而表現出更高的表面疏水性，更易在油水界面形三維網絡，當形成的網狀結構速度大于脂肪上浮的速度時，就會一定程度上抑制脂肪上浮，由此可見，SPI纖維化程度越高，乳液的脂肪上浮穩定性越高［7］。

圖7 3 種蛋白乳液在不同油相比下的脂肪上浮情況

3 結論

以SPI 和由鹽酸和醋酸誘導的SPI 纖維為研究對象，對比研究其結構特征、乳化特性、凝膠特性及成膜性質的差異。AFM、CD等實驗分析表明在酸熱處理下淀粉樣原纖維的形成，并且由醋酸誘導的纖維化蛋白β－折疊結構比例最高。纖維化處理不僅提高了SPI的凝膠硬度與持水性，并顯著改善了SPI薄膜的機械性能和阻隔性能，尤其是C －SPI型薄膜對SPI 薄膜柔韌性的改變顯著。在質量濃度為1 mg／100 mL條件下，蛋白纖維穩定的乳液具有更優的乳化活性和脂肪上浮穩定性，且穩定程度與纖維化程度呈正相關。因此，可通過選擇合適的酸誘導劑種類，調控蛋白的纖維化程度，實現蛋白纖維材料功能特性的優化，為基于蛋白纖維的新型納米材料的研發提供參考。