谷氨酰胺轉氨酶介導的蕎麥蛋白－花生蛋白交聯及其功能特性研究

陳方圓，金 建，藍許諾

（西南科技大學生命科學與工程學院，綿陽 621010）

蛋白質是一種非常重要的營養物質和食品加工原料，其中蕎麥蛋白因富含谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸及賴氨酸，能夠與缺乏賴氨酸的部分谷類互補，滿足人們對必需氨基酸的需要［1］，同時蕎麥蛋白作為一種優質的植物蛋白質來源，有抗氧化、抗衰老、調節腸道菌群等［2］優良的生物活性，成為動物蛋白質的優質替代源之一，受到蛋白質科學領域越來越多的關注。研究表明，蕎麥蛋白質主要由高水平的清蛋白和球蛋白，低水平的醇溶蛋白和谷蛋白組成，其缺乏高分子質量蛋白組分，富含中、低分子質量蛋白質組分［3］。由于蕎麥蛋白質成分和結構的限制，導致天然蛋白質的溶解性、發泡性、乳化性、持油性等性能較差，同時單一蛋白的營養價值低［4］，其功能性質難以滿足新興食品開發與生產的需要［5］。

蛋白質的功能特性與其結構密切相關，蛋白質的結構修飾可以改善其功能性［6－8］。蛋白質的交聯是蛋白質結構修飾的重要方法之一，進行蛋白質交聯，利用蛋白質互補作用，提高蕎麥蛋白質的營養價值。花生蛋白質是一種完全蛋白質，極易被人體吸收利用，其消化系數超過90%［9］，故可以選用花生蛋白質進行交交聯，提高蕎麥蛋白的營養價值。酶法交聯具有條件溫和、無毒以及底物特異性等優點，其中以谷氨酰胺轉氨酶（TGase）最為典型，研究也最為廣泛，TG酶介導蛋白質交聯能夠提高蛋白質的熱穩定性和持水力，有助于形成強有力的凝膠，改善蛋白質制品的品質［10，11］，同時還可以催化蛋白質發生脫酰胺反應，改善乳化性和起泡性［12］，研究表明，TG酶法交聯制備的蛋白質的功能特性有明顯改善［13，14］。

本研究采用TG 酶在不同條件下蕎麥蛋白和花生蛋白進行交聯，系統研究蛋白質比例、總蛋白質量濃度、TG 酶質量分數、溫度、時間和pH 對蛋白質交聯的影響，以及2 種植物蛋白交聯后的功能特性變化，為植物蛋白質以及植物基食品的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大涼山黑苦蕎粉（食品級）、花生蛋白、氫氧化鈉（分析純）、檸檬酸（分析純）、磷酸氫二鈉（十二水）（分析純）、L －絲氨酸（分析純）、鹽酸（分析純）、谷氨酰胺轉氨酶（分析純）、鄰苯二甲醛（分析純）、福林酚試劑（分析純）。

1.2 儀器與設備

78 －1 磁力加熱攪拌器、PHS－3E pH計、KDN－102C 定氮儀、TD4Z 離心機、冷凍干燥機、UV －1800PC紫外可見分光光度計、XH －C 旋渦混合器、HH－6 數顯恒溫水浴鍋。

1.3 實驗方法

1.3.1 蛋白質提取與測定

1.3.1.1 蕎麥蛋白提取和測定

采用堿提酸沉法提取蕎麥蛋白［15，16］。稱取一定量的蕎麥粉，在料液比1∶15（g∶mL）、pH 9.0、溫度50 ℃條件下提取1.5 h 得到提取液，5 000 r／min 離心15 min，收集上清液，并用0.1 mol／L HCl 溶液調節pI 4.5，靜置沉淀2 h后5 000 r／min離心15 min，收集沉淀，用水沖洗并用0.1 mol／L NaOH溶液將pH調至中性，冷凍干燥，得到蕎麥分離蛋白，儲藏于干燥器中備用。

1.3.1.2 蕎麥蛋白與花生粗蛋白含量的測定

蕎麥蛋白和花生蛋白的粗蛋白含量采用凱氏定氮法測定［17］。

1.3.2 交聯度測定

1.3.2.1 絲氨酸標準曲線繪制

采用鄰苯二甲醛（OPA）法［18，19］測定絲氨酸質量濃度，移取質量濃度為0.1 mg／mL 絲氨酸標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，去離子水補充體積至2 mL，移取0. 8 mL 至比色皿中，加入6 mL 0. 8 mg／mL OPA 溶液，混勻，避光準確反應2 min 后，使用空白對照進行調零，在波長340 nm 處測定吸光度，以絲氨酸質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.2.2 游離氨基的測定

取1 mL待測液，按照1.3.2.1中的方法測吸光度值，重復測試3次。游離氨基含量的計算見式（1）。

式中：Wserine－NH2為每克蛋白中所含有L －絲氨酸含量／mmol／g；X為樣品質量／g；P為樣品中蛋白質質量分數／%；V為樣品體積／L；N為稀釋倍數。

1.3.2.3 蛋白質交聯度的測定

分別測定交聯前后蛋白樣品的總游離氨基含量［20］，交聯度計算見式（2）。

式中：Ac為交聯后蛋白質游離氨基含量／mmol／g；A0為交聯前蛋白質的總游離氨基含量／mmol／g。

1.3.3 蕎麥蛋白－花生蛋白交聯反應的單因素實驗

1.3.3.1 質量比對蕎麥蛋白－花生蛋白交聯反應的影響

按照質量比1∶1、1∶2、2∶1、3∶4、4∶3 分別稱取一定質量的蕎麥蛋白粉和花生蛋白粉，溶于pH 7.0 的磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液中，調節蛋白質質量濃度至10 g／100 mL，按酶底質量比加入1. 25%的TGase，混合均勻后取5 mL 溶液于4 000 r／min 離心20 min，取上清液并定容至10 mL，記為交聯前蛋白質溶液，稀釋一定倍數后采用OPA 法測定游離氨基含量；剩余的蛋白質溶液，50 ℃恒溫水浴反應2 h，4 000 r／min離心20 min，收集上清液，記為交聯后蛋白質溶液，用OPA方法檢測游離氨基含量。

1.3.3.2 蛋白質量濃度對蕎麥蛋白－花生蛋白交聯反應的影響

在蕎麥蛋白和花生蛋白質量比1∶1 的條件下，將蛋白質量濃度調至2、4、6、8、10 g／100 mL，按酶底質量比加入1. 25%的TGase，調節pH 至7. 0，在50 ℃恒溫下反應2 h，其余操作同1.3.1.1。

1.3.3.3 酶質量分數對蕎麥蛋白－花生蛋白交聯反應的影響

在蕎麥蛋白和花生蛋白質量比1∶1 的條件下，配制質量濃度為10 g／ 100 mL 的蛋白質溶液，按酶底質量比分別加入0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%的TGase，調節pH 至7.0，50 ℃恒溫反應2 h，其余操作同1.3.1.1。

1.3.3.4 pH 對蕎麥蛋白－花生蛋白交聯反應的影響

在蕎麥蛋白粉與花生蛋白粉的質量比例為1∶1的條件下，配制質量濃度為10 g／100 mL 的蛋白質溶液，按酶底質量比加入1.25%的TGase 分別加入pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 的磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液，在50 ℃恒溫下反應2 h，其余操作同1.3.1.1。

1.3.3.5 溫度對蕎麥蛋白－花生蛋白交聯反應的影響

在蕎麥蛋白粉與花生蛋白粉的質量比例為1∶1條件下，配制質量質濃度為10 g／ 100 mL的蛋白質溶液，按酶底質量比加入1.25%的TGase，分別在30、40、50、60、70 ℃恒溫反應2 h，其余操作同1.3.1.1。

1.3.3.6 反應時間對蕎麥蛋白－花生蛋白交聯反應的影響

在蕎麥蛋白粉與花生蛋白粉的質量比例為1∶1條件下，配制質量質濃度為10 g／100 mL的蛋白質溶液，按酶底質量比加入1.25%的TGase，在50 ℃恒溫下反應30、60、90、120、150、180 min，其余操作同1.3.1.1。

1.3.4 蛋白質功能特性的測定

1.3.4.1 持水性的測定

蛋白質持水性的測定參照王韻儀等［21］的方法。干燥離心管稱質量，取0.2 g 蛋白質試樣加入10 mL蒸餾水，用旋渦混合器攪拌，混勻，4 000 r／min 離心20 min，上清液稱質量。通過式（3）計算持水性。

式中：W0為加入蛋白粉干質量／g；W1為離心管和蛋白質質量之和／g；W2為離心后離心管和蛋白質質量之和／g。

1.3.4.2 持油性的測定

持油性的測定參照邵悅等［22］的方法。干燥離心管質量，取1 g蛋白試樣加入3 mL菜籽油，使用旋渦混合器使蛋白樣品和菜籽油充分混合，1 000 r／min離心25 min，緩慢倒出上清液，離心管和蛋白樣品稱。通過式（4）計算持油性。

式中：W0為加入蛋白粉干質量／g；Wa為離心管和蛋白質質量之和／g；Wb為離心后離心管的質量／g。

1.3.4.3 起泡性及起泡穩定性的測定

蛋白樣品的起泡性和起泡穩定性的測定參照蔡慧農等［23］的方法。準確稱取2 g 蛋白樣品于離心管中，加入20 mL蒸餾水，使用旋渦混合器使其混合均勻，測量均質前溶液體積，記為VC；在高速剪切機中8 000 r／min均質2 min，測量蛋白液總體積Vf0及泡沫體積；將均質后蛋白液靜置30 min 后測量溶液總體積Vf30與泡沫體積。重復測定3 次。通過式（5）和式（6）計算起泡性和起泡穩定性。

式中：VC為均質前溶液體積／mL；Vf0為均質后溶液總體積／mL。

式中：VC為均質前溶液體積／mL；Vf30為均質靜置30 min后溶液總體積／mL。

1.3.4.4 乳化性及乳化穩定性的測定

蛋白質的乳化性和乳化穩定性的測定參照趙璞等［24］的方法。取0.2 g 蛋白樣品配成質量濃度為2 g／100 mL蛋白溶液，與3.33 mL 菜籽油混合，在高速剪切機中均質2 min，立即取出50 μL乳狀液，與5 mL 體積分數為1%的SDS溶液混合均勻，在500 nm處測量吸光度值A0，靜置10 min 后按照相同方法測量乳狀液吸光度值A10。計算乳化性和乳化穩定性：

式中：A0為0 min 吸光度值；φ 為樣品溶液油的體積分數；c 為未乳化時蛋白樣品溶液質量濃度／g／mL；n為稀釋倍數；A10為乳液放置10 min 后吸光度值；EAI為乳化活性指數／m2／g；ESI 為乳化穩定性指數／%。

1.3.4.5 溶解度的測定

采用Lowry 法［26］測定蛋白質含量來表征溶解度。配制質量濃度為1 g／100 mL 的蛋白溶液，分別調節pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12. 0，渦旋混合均勻后于4 000 r／min 離心20 min，取1 mL 上清液按Lowry 法進行測定吸光度值，等量蒸餾水代替樣品做空白對照，并根據標準曲線計算出樣品溶液的蛋白質質量濃度。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 蛋白質比例對蕎麥蛋白－花生蛋白交聯的影響

由圖1 可以看出，在以2 種蛋白質量比例為單因素實驗中，當質量比為1∶1 時，交聯前后游離氨基含量減少，發生了交聯反應，而當蛋白比例為1∶2、2∶1、3∶4、4∶3 時，交聯前后游離氨基含量增加。這可能是當2 種蛋白質占比相同時能在TG 酶作用下充分作用結合生成交聯蛋白質，當蛋白比例高于或低于1∶1時，含量較多的蛋白質在TG酶作用下其γ －甲酰胺基供體或ε－氨基受體沒有相應的受體或供體，主要以游離氨基酸的形式存在于溶液中，導致游離氨基含量增加［27］。蕎麥蛋白－花生蛋白質量比例為1∶1為最優質量比，后續實驗依此進行。

圖1 蛋白質比例對蕎麥蛋白－花生蛋白交聯的影響

2.1.2 蛋白質質量濃度對蕎麥蛋白－花生蛋白交聯反應的影響

由圖2 可知，在蛋白質量濃度為變量的單因素實驗中，以蛋白質量濃度4 g／100 mL時，交聯前后游離氨基含量減小，這說明能用少量的蛋白即可發生交聯反應；當蛋白質量濃度超過4 g／100 mL時，底物濃度的升高，交聯前后游離氨基含量增加，說明未發生交聯反應或者交聯過度，這可能是因為蛋白質質量濃度過高，未被TG 酶充分飽和［27］。蛋白質量濃度4 g／100 mL為最優，后續實驗依此進行。

2.1.3 酶質量分數對蕎麥蛋白－花生蛋白交聯反應的影響

由圖3 可知，在TG酶誘導蛋白質交聯反應過程中，酶質量分數對交聯反應有很重要的影響。酶質量分數為0.25% ～0.75%時，交聯后游離氨基含量大于交聯前游離氨基含量，可能是發生了脫氨基作用，導致游離氨基含量增加。酶質量分數大于1%，交聯后游離氨基含量減小，可能是因為TG酶對蕎麥蛋白與花生蛋白的交聯作用，使賴氨酸的ε －氨基與谷氨酰胺的酰胺基發生反應，產生異肽鍵，導致游離氨基的減小［28］。因此，選取1.25%酶質量分數為最優量，后續實驗依此進行。

圖3 酶質量分數對蕎麥蛋白－花生蛋白交聯反應的影響

2.1.4 pH對蕎麥蛋白－花生蛋白交聯反應的影響

由圖4 可知，體系pH為4 ～5 時，交聯前后游離氨基含量沒有明顯變化，體系pH 為6 時，交聯前后體系游離氨基含量開始減小，說明發生了交聯反應，這可能是因為交聯后的蛋白質在pH 為6 時溶解度增大，TG酶催化交聯后的蛋白質的谷氨酰胺殘基與賴氨酸形成分子內和分子間的異肽鍵，導致交聯前后游離氨基含量減小［22］。TG 酶在pH 5 ～8 之間較穩定［29］，且pH 7.0 與pH 8.0 之間的游離氨基含量差異顯著（P ＜0.05），選取pH 8.0 為最優pH。

圖4 pH對蕎麥蛋白－花生蛋白交聯反應的影響

2.1.5 反應溫度對蕎麥蛋白－花生蛋白交聯反應的影響

由于溫度對酶的活性和分子運動有一定的影響，在適宜的溫度范圍內，對反應有一定的促進作用［28］。如圖5 所示，當反應溫度達到40 ～50 ℃時，發生了交聯反應；體系溫度超過50 ℃時，交聯反應過度或停止。TG 酶最適溫度約為45 ℃，且溫度40 ℃與溫度50 ℃下的游離氨基含量差異顯著（P ＜0.05），選取反應溫度為40 ℃為最佳反應條件。

圖5 反應溫度對蕎麥蛋白－花生蛋白交聯反應的影響

2.1.6 反應時間對蕎麥蛋白－花生蛋白交聯反應的影響

由圖6 可知，在TG酶誘導蛋白質交聯反應過程中，不同的交聯時間對其交聯有不同的效果。反應120 min時，TG酶對底物蛋白質底物充分作用，交聯后游離氨基含量在減小，發生了交聯反應，而反應時間超過120 min，交聯后游離氨基含量反而增加，可能是交聯之后蛋白質的溶解度增加或者發生了蛋白質的水解反應［28］。因此，選取反應時間120 min 為最優反應時間。

圖6 反應時間對蕎麥蛋白－花生蛋白交聯反應的影響

蛋白質量濃度4 g／100 mL，蕎麥蛋白－花生蛋白質量比1∶1，TG酶質量分數1.25%，反應時間120 min，反應pH 8.0，反應溫度40 ℃為蕎麥蛋白－花生蛋白交聯的最優工藝條件。

2.2 交聯度測定結果

對冷凍干燥后的交聯后蛋白質和交聯前蛋白質分別測定游離氨基含量結果見表1。

表1 交聯反應前后蛋白質游離氨基含量

由表1 可以看出，交聯前蛋白質的游離氨基含量為（0.439 ±0.03）mmol／g，交聯后蛋白質的游離氨基含量為（0.162 ±0.008）mmol／g，這表明交聯后體系中游離氨基含量顯著減小（P ＜0.05），發生了交聯反應，計算得到交聯度為63.1%。

2.3 蛋白質功能特性結果分析

2.3.1 持水性

持水性如圖7 所示，交聯后蛋白持水性為5.18 g／g，交聯前蛋白持水性為3.03 g／g，花生蛋白和蕎麥蛋白持水性分別為2.06、3.84 g／g。與未交聯的蛋白質、花生蛋白和蕎麥蛋白相比，持水性有所提高，這可能是因為交聯反應使蛋白質的二級結構發生變化，暴露了更多的親水肽鏈，或者TG 酶誘導產生的交聯后的蛋白形成了新的化學鍵，增強了蛋白質的網狀結構，增加了水分子留存的空間，提高了交聯后的蛋白質的持水性［22］。

圖7 交聯反應對蛋白質持水性測定的影響

2.3.2 持油性

如圖8 所示，交聯后蛋白質蛋白持油性為2.25 g／g，交聯前蛋白質持油性為1.17 g／g，花生蛋白和蕎麥蛋白持油性分別為1.05、1.35 g／g。與未交聯的蛋白質、花生蛋白和蕎麥蛋白相比，持油性有所提高，這可能是因為酶交聯反應和冷凍干燥使得聚合物增多，截留了脂肪，進而提高了持油性［21］。

圖8 交聯反應對蛋白質持油性測定的影響

2.3.3 起泡性和起泡穩定性

如圖9 所示，交聯后蛋白質的起泡性為8.69%，而交聯前蛋白質的起泡性為18.37%，花生蛋白和蕎麥蛋白的起泡性分別為16.44%和13.41%，與未交聯的蛋白質、花生蛋白和蕎麥蛋白相比，交聯后的蛋白質起泡性降低。交聯后蛋白質的起泡穩定性為51.63%，而交聯前蛋白質的起泡穩定性為55.69%，花生蛋白和蕎麥蛋白的起泡穩定性分別為85.32%和75.23%，與未交聯的蛋白質、花生蛋白和蕎麥蛋白相比，起泡穩定性降低，這可能是因為交聯反應形成了高分子不溶交聯物，導致起泡性和起泡穩定性下降［29，30］。由此可得，TG 酶誘導蛋白質交聯，當交聯到一定程度時，可能會導致發泡性和起泡穩定性的下降。

圖9 交聯反應對蛋白質起泡性與起泡穩定性測定的影響

2.3.4 乳化性和乳化穩定性

如圖10 所示，交聯后蛋白質乳化性為2.20 m2／g，交聯前蛋白質乳化性為2.77 m2／g，花生蛋白乳化性為7.33 m2／g，蕎麥蛋白乳化性為3.54 m2／g，與未交聯的蛋白質、花生蛋白和蕎麥蛋白相比，交聯后蛋白質乳化性降低。可能是與未交聯的蛋白質相比，交聯蛋白質溶解度降低［31］，或者在體系pH 為8.0 時，交聯反應產生大量的高分子不溶交聯物，使得乳化能力降低［32］。

圖10 交聯反應對蛋白質乳化性與乳化穩定性測定的影響

交聯后蛋白質乳化穩定性為92.95%，交聯前蛋白質乳化穩定性為80.53%，花生蛋白乳化穩定性為33.66%，蕎麥蛋白乳化穩定性為50.38%，與未交聯的蛋白質、花生蛋白和蕎麥蛋白相比，乳化穩定性有所提高。可能是因為交聯后的蛋白質的支鏈結構增加了體系空間穩定性，使得蛋白質－蛋白質、蛋白質－基質具有更強的粘附作用［29］，從而增加了交聯后的蛋白質的乳化穩定性。由此可得，經TG酶誘導花生蛋白和蕎麥蛋白交聯反應可能使得蛋白質乳化性下降，乳化穩定性增強。

2.3.5 交聯反應對蛋白質溶解度的影響

如圖11 所示，在pH 4.0 處，花生蛋白的溶解度較低，在pH ＜4 或＞4 時，溶解度逐漸增加，可見pH 4.0 處為花生蛋白質的等電點。蕎麥蛋白在等電點pH 4.0 附近溶解度較低，可能是因為蕎麥蛋白疏水基團在外側與水分子之間產生排斥力，導致溶解度下降［33］。交聯后的蛋白質在pH 3 ～12，其溶解度逐漸升高，交聯后的蛋白質與單一蛋白質在等電點pI 4.0 處的溶解度明顯提高，但交聯后蛋白質溶解度與蕎麥蛋白溶解度相差不大而對花生蛋白發溶解度有很大的提高。與未交聯的蛋白質相比，交聯后的蛋白質的溶解度明顯降低，這可能是因為交聯反應產生了高分子不溶聚合物或者蛋白質結構發生了變化［34，35］。

圖11 交聯反應對蛋白質溶解度測定的影響

3 結論

本研究主要探討了TG 酶誘導蕎麥蛋白－花生蛋白交聯的最佳交聯工藝條件，通過單因素實驗確定了交聯反應工藝各個因素最佳水平為蕎麥蛋白和花生蛋白比例1∶1、時間120 min、pH 8.0、溫度40℃、TG 酶質量分數1. 25%、總蛋白質量濃度4 g／100 mL。在最佳交聯工藝條件下制備得到蛋白質樣品進行功能性研究，發現交聯后蛋白質的持水性、持油性和乳化穩定性有所提高，乳化性、起泡性和起泡穩定性有所降低，交聯蛋白的溶解度較未交聯蛋白溶解度明顯下降。本研究對于改善蛋白食品的質構和加工性能提供了依據，可為后續植物蛋白質的開發與利用提供參考。