英國紅蕓豆抗氧化肽對氧化應激斑馬魚的保護作用研究

李 琳，陳 丹，范曉禹，鄭喜群，崔素萍

（黑龍江八一農墾大學食品學院1，大慶 163319）

（國家雜糧工程技術研究中心2，大慶 163319）

（糧食副產物加工與利用教育部工程研究中心3，大慶 163319）

生物體內的氧化應激與活性氧（ROS）產生和清除的不平衡有關。正常情況下，機體的抗氧化防御系統可以有效清除人體細胞在代謝過程中產生的ROS。當ROS 產生過多或機體抗氧化防御系統失效時，機體將處于氧化應激狀態。目前已知氧化應激引起的損害可導致癌癥［1］、糖尿病［2］、炎癥［3］、心血管疾病［4］等多種慢性疾病。

生物活性肽是蛋白質的水解產物，由2 ～20 個氨基酸殘基組成，具有抗氧化、抗脂代謝紊亂、抗菌、抗癌、降壓、免疫調節等作用，且具有無副作用、易于人體代謝等優點［5］，這些功能是原始蛋白質不具備的［6］。開發能夠調控抗氧化和脂質代謝的生物活性肽已成為研究熱點。Shi 等［7］研究發現，鷹嘴豆肽具有降血脂作用，可以調節肥胖大鼠的由高脂肪飲食引起的脂質代謝異常。鄭義等［8］研究發現，銀杏葉肽可以調節由高脂肪飲食誘發的高脂血癥小鼠的脂質代謝異常，以及增加抗氧化能力和抑制機體抗炎細胞因子的表達。

與體外抗氧化活性研究相比，動物實驗更能真實模擬體內環境。斑馬魚作為模式生物，其體型小、繁殖快，與人類基因組高度同源［9］。發育至第5 天就能夠自主運動，便于對其行為活動進行實時監測，其對于毒性的敏感性在一定程度上高于哺乳動物［10］。近年來，斑馬魚被作為一種新型實驗動物模型來研究氧化應激的傷害［11－13］。Ko 等［14］研究發現牙鲆魚源多肽是一種天然抗氧化劑，對AAPH 誘導的氧化應激斑馬魚有保護作用。Ding等［15］用酶解法從鹿茸中提取抗氧化肽，發現其具有較強的體外抗氧化活性，且對氧化應激斑馬魚有保護作用。Huang等［16］研究評價鄰苯二甲酸二（2 －乙基己基）酯（DEHP）對斑馬魚的神經行為毒性評價，行為學結果顯示，DEHP抑制了自發尾運動，降低了斑馬魚自主活動。Tamagno 等［17］研究了添加去鐵胺的巴拉圭茶葉提取物對斑馬魚行為和抗氧化性的影響，發現二者單獨使用時均使斑馬魚表現出類似焦慮行為，而同時應用時，提取物抗氧化性提高，斑馬魚行為趨于正常。

英國紅蕓豆（Phaseolus vulgaris L.）是一種重要的食用豆類作物，是黑龍江省蕓豆主栽品種之一［18］。含有豐富的蛋白質［19］，且具有高鉀、高鎂、低鈉，有較高的營養和藥用價值等特點［20］，深受消費者喜歡。為了開發具有高附加值的英國紅蕓豆蛋白功能性產品，團隊在前期工作中，采用差示熱量掃描法和Schaal 烘箱法研究發現，英國紅蕓豆抗氧化肽＜1 ku組分（British red kidney bean protein antioxidant components，BRKBPAPC）對大豆油的抗氧化及熱穩定性均有一定作用［21，22］，通過細胞實驗發現BRKBPAPC對H2O2引起的PC12 細胞氧化損傷具有一定的保護作用［23］。本文研究BRKBPAPC 對氧化損傷斑馬魚的保護作用，進一步闡明BRKBPAPC 在生物體內的抗氧化作用機制，為BRKBPAPC 在功能性食品開發等領域提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

斑馬魚（體長約3.5 cm，體質量約0.46 g），為3 ～4月齡；斑馬魚飼料（粗蛋白質量分數≥48%、粗脂肪質量分數≥8%）。

1.2 實驗試劑

堿性蛋白酶（酶活力≥20 萬U／g）、維生素C、偶氮二異丁脒鹽酸鹽（AAPH）、丙二醛（MDA）測定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）活性測定試劑盒、過氧化氫酶（CAT）活性測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH － Px）測定試劑盒，總抗氧化能力（T － AOC）測定試劑盒，甘油三酯（TG）測定試劑盒、總膽固醇（TC）測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（HDL － C）測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（LDL －C）測定試劑盒，其他無機試劑均為分析純。

1.3 試驗儀器

ZSHW 型電熱恒溫水浴鍋，LGR10 臺式高速離心機，Pha 1 －2 LD plus型冷凍干燥機，U－2910 型紫外分光光度計，RNF－0460 卷式膜多功能小試設備，TGrinder 電動組織研磨器套裝OSE －Y30 斑馬魚養殖系統，Cf72 －8YW 酶聯免疫檢測儀，Zebralab 斑馬魚行為軌跡分析系統。

1.4 實驗方法

1.4.1 英國紅蕓豆抗氧化肽組分的制備

英國紅蕓豆經扒皮、烘干、打粉后用堿溶酸沉的方法制備英國紅蕓豆蛋白質，利用堿性蛋白酶酶解制備英國紅蕓豆抗氧化肽，并將酶解產物進行超濾，得到分子質量＜1 ku 組分冷凍干燥備用。粒徑主要分布在400 ～800 nm 之間。英國紅蕓豆抗氧化肽＜1 ku組分的具體制備方法見參考文獻［24］。

1.4.2 斑馬魚飼養

斑馬魚飼養方法參照文獻［25］略有改動，將自來水提前3 d 曝氣，再轉移至斑馬魚養殖系統，保持水溫（28 ±1）℃，pH 值為7.0 ～7.5，電導率為400 ～600 μs／cm，日光燈照射14 h，黑暗10 h。然后，將斑馬魚轉移至養殖系統后禁食，等斑馬魚從容游動后喂食，每天飼喂2 次（9：00 和18：00）并清除排泄物，每條斑馬魚每次喂食3 mg，喂養7 d 開始后續試驗。

1.4.3 氧化應激斑馬魚模型建立及抗氧化肽濃度的確定

斑馬魚給藥劑量急性毒性預試驗具體方法見參考文獻［26］：將斑馬魚分別浸泡在不同濃度AAPH溶液中（10、15、20、25、30 mmol／L），觀察斑馬魚的死亡情況，發現20 min 后20、25、30 mmol／L 組內斑馬魚均出現死亡情況，30 min 后，25、30 mmol／L 組內斑馬魚全部死亡，確定AAPH誘導濃度為20 mmol／L，每天處理時間為10 min。將斑馬魚分別浸泡在質量濃度為100、300、500、700、1 000 mg／L BRKBPAPC 溶液中，以斑馬魚頭部有無紅色充血現象作為確定斑馬魚抗氧化肽的最大耐受劑量依據［27］。發現30 min后700、1 000 mg／L斑馬魚頭部充血有紅斑，后將斑馬魚浸泡在600 mg／L肽溶液中，斑馬魚頭部同樣出現紅斑。確定斑馬魚最大耐受劑量為500 mg／L，斑馬魚最大耐受劑量設為高劑量組，并依次遞減確定中、低劑量組，處理時間為每日30 min。

1.4.4 實驗動物分組及處理方式

斑馬魚具體分組及處理方法如表1 所示。以每組（缸）10 條魚飼養在3 L 帶有過濾裝置和供氧裝置的斑馬魚養殖設備中，每組設置3 個平行，共18 組（缸）。在實驗過程中，對照組僅用養殖系統水處理，其余各組每天9∶00 喂食后處理。處理方式為：將各組斑馬魚分別撈出至相應分組的1.5 L容器中，容器中裝有0.5 L 相應濃度溶液。每天處理完成后將斑馬魚轉移回養殖系統內。

表1 實驗動物分組及處理方式

1.4.5 指標檢測方法

按1.4.4 分組處理7、14、21 d后分別取樣，從每組（缸）中隨機選取2 尾斑馬魚放入冰水混合液中致死，1 min后取出用超純水清洗，準確稱取斑馬魚質量，加入9 倍的生理鹽水制備質量分數10%斑馬魚勻漿，按照試劑盒說明書測定CAT、SOD、MDA、T －AOC、GSH－Px、TG、TC、HDL－C、LDL－C。

1.4.6 斑馬魚行為學檢測方法

利用斑馬魚行為軌跡分析系統監測斑馬魚10 min內的行為軌跡。斑馬魚按1.4.4 分組處理，分別在7、14、21 d 時各組隨機選取1 只斑馬魚置于1 000 mL燒杯中放入Zebralab 行為學檢測系統中，設置斑馬魚移動最大閾值為10 cm／s，最小閾值為1 cm／s，測定行為時間為10 min。

1.5 統計學分析

所有實驗做3 次獨立重復，利用Excel軟件繪制相關圖表，采用SPSS 22.0 統計軟件方差分析（ANVOA）進行統計學分析。以P ＜0.05 代表數據間差異顯著。實驗數據以均數±標準差（±S）表示。

2 結果與分析

2.1 英國紅蕓豆抗氧化肽組分對斑馬魚抗氧化系統的影響

2.1.1 英國紅蕓豆抗氧化肽組分對斑馬魚CAT 活力的影響

氧化應激會導致機體抗氧化系統受到損傷、抗氧化酶活性改變，進而導致各種疾病的發生［28］。CAT 是生物體內主要的抗氧化酶之一，可使機體自由基的產生與清除處于動態平衡，保護機體免受氧化應激的傷害。BRKBPAPC 處理對斑馬魚CAT 活力的影響見圖1。與對照組相比，經AAPH處理后的斑馬魚體內CAT 活力顯著下降（P ＜0.05）；與模型組相比，經過低、中、高濃度BRKBPAPC 處理后CAT活力有不同程度的提高。高劑量組效果最好且優與VC 組，在處理21 d 后增至（28. 29 ±3. 29）U／mg prot。隨著AAPH 處理斑馬魚時間的延長，斑馬魚體內的CAT 活力逐漸降低，且在21 d 時降至最低為（12.84 ±1.44）U／mg prot。肽處理時間增加，斑馬魚體內的CAT 活力有所提高之后保持穩定。

圖1 BRKBPAPC處理對斑馬魚體內CAT活力影響

2.1.2 英國紅蕓豆抗氧化肽組分對斑馬魚SOD 活力的影響

SOD 被視為生物體中最重要的抗氧化酶，是人體內的垃圾清道夫，可聯合CAT 酶清除機體內過量的自由基［29］。BRKBPAPC 處理對斑馬魚SOD 活力的影響見圖2。

圖2 BRKBPAPC處理對斑馬魚體內SOD活力影響

由圖2 可知，AAPH 處理引起了氧化應激，以致機體SOD 酶活顯著降低（P ＜0.05）。BRKBPAPC 組中SOD 活力出現劑量依賴關系，但都表現出對機體的保護作用，尤其是高劑量組作用更為明顯，但與VC 組差異不顯著（P ＞0.05）。經高劑量組抗氧化肽處理21 d 后，斑馬魚SOD 活力增長至最高為（126.59 ±6.39）U／mg prot。這可能是因為BRKBPAPC 可有效清除氧化應激斑馬魚體內過量的ROS，維持斑馬魚抗氧化酶活力正常。

2.1.3 英國紅蕓豆抗氧化肽組分對斑馬魚丙二醛（MDA）活力的影響

外源性污染物誘導斑馬魚產生的大量氧自由基如果得不到及時清除，就會與生物膜中的不飽和脂肪酸結合，引起脂質過氧化反應，并因此形成脂質過氧化物。MDA 含量的高低間接反映了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度，因此MDA 被認為是反映機體氧化損傷最具代表性的指標之一［30］。BRKBPAPC處理對斑馬魚MDA 活力的影響見圖3。

圖3 BRKBPAPC處理對斑馬魚體內MDA影響

由圖3可知，與對照組相比，模型組的MDA含量顯著升高（P ＜0.05），在21 d時增至最高，為（6.23 ±0.12）nmol／mg prot。BRKBPAPC 組的MDA 生成量隨處理時間增加而顯著降低（P ＜0.05），高劑量組效果與VC 組差異不顯著（P ＞0.05）。經高劑量肽處理后，MDA含量降至（3.35 ±0.29）nmol／mg prot。這可能是因為BRKBPAPC 濃度越高，對機體的保護作用越大。

2.1.4 英國紅蕓豆抗氧化肽組分對斑馬魚總抗氧化能力（T－AOC）活力的影響

T－AOC 是近年研究發現的用于衡量機體抗氧化酶系統和非酶促系統功能狀況的綜合性指標，可反映機體抗氧化酶系統和非酶系統對外來刺激的代償能力以及機體自由基代謝的狀態［31］。BRKBPAPC 處理對斑馬魚T－AOC 的影響見圖4。

圖4 BRKBPAPC對斑馬魚T－AOC影響

由圖4 可知，與其他組相比，模型組總抗氧化能力顯著降低（P ＜0.05）；與模型組相比，經不同濃度BRKBPAPC處理后，總抗氧化能力有不同程度的提高，且與BRKBPAPC 成濃度依賴關系，隨著肽濃度的增加，總抗氧化能力也升高。經過21 d 高劑量BRKBPAPC 處理后斑馬魚T －AOC 增長至（2.07 ±0.18）U／mg prot。高劑量組效果優于VC 組，且與對照組接近。這可能是由于氧化損傷引起了抗氧化酶活性的降低，BRKBPAPC 通過保護機體細胞膜的完整性，提高了機體的抗氧化能力。

2.1.5 英國紅蕓豆抗氧化肽組分對斑馬魚谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－Px）活力的影響

谷胱甘肽過氧化物酶（GSH －Px）是一種過氧化物分解酶，可以清除由ROS 自由基誘發的脂質過氧化物，保護細胞膜結構和功能的完整性［32］。BRKBPAPC 對斑馬魚GSH－Px 的影響結果見圖5。

由圖5 可知，與對照組相比，模型組的GSH －Px活力顯著降低（P ＜0.05），21 d 降至（41.61 ±8.97）U／mg prot。在經過BRKBPAPC 處理后，與模型組相比，GSH－Px 活力在低、中、高3 個劑量組中均顯著增加（P ＜0.05），且GSH －Px 與抗氧化肽濃度呈現正相關。經高劑量肽處理后，增長至（84.75 ±7.77）U／mg prot。高劑量肽組與VC組對GSH－Px 的影響差異不顯著（P ＞0.05）。

Li 等［33］研究發現牡丹籽蛋白肽對氧化應激斑馬魚有良好的保護作用，可降低斑馬魚MDA 濃度，提高T－AOC、CAT、SOD、GSH －Px 酶活力。穆秋霞等［24］發現BRKBAPC能緩解H2O2對PC12 造成的細胞生長抑制作用，隨著肽濃度的提高，細胞內MDA含量降低，SOD、CAT活力以及GSH含量均具有所提高。本研究結果與前人研究結果一致［33，24］。BRKBPAPC可降低斑馬魚體內MDA 含量，提高多種抗氧化酶活力。可由此表明，BRKBPAPC 可能通過保護斑馬魚抗氧化系統的生理功能，清除了部分ROS，減輕ROS 對斑馬魚體內抗氧化酶系的破壞作用，維持了抗氧化系統的正常運行。

2.2 英國紅蕓豆抗氧化肽組分對斑馬魚脂代謝的影響

2.2.1 英國紅蕓豆抗氧化肽組分對斑馬魚體質量的影響

氧化應激會引起斑馬魚進食量變小，進食速度減慢。按1.4.4 分組連續處理21 d斑馬魚體質量變化見圖6。

圖6 BRKBPAPC處理對斑馬魚體質量的影響

由圖6 可知，與模型組相比，BRKBPAPC處理可以改善應激斑馬魚體重。低劑量、中劑量和高劑量組斑馬魚體質量顯著增加（P ＜0.05），高劑量組斑馬魚體質量與對照組差異不顯著（P ＜0.05）。

2.2.2 英國紅蕓豆抗氧化肽組分對斑馬魚總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白固醇（LDL －C）、高密度脂蛋白固醇（HDL－C）的影響

膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白固醇（LDL－C）和高密度脂蛋白固醇（HDL－C）水平能夠最為直觀的表現脂質代謝的情況。

甘油三酯是脂質的一個組成部分，其主要功能是提供和儲存能量［34］。總膽固醇是參與多種生物合成的重要脂質。當體內TC、LDL －C、HDL －C 偏低時會導致血管脆性增大、免疫力降低、引起肝功能異常，導致多種疾病發生［35］。按1.4.4 分組連續處理21 d英國紅蕓豆抗氧化肽組分對斑馬魚脂代謝影響見表2。

表2 英國紅蕓豆抗氧化肽組分對斑馬魚脂代謝的影響／mmol／g prot

由表2可知，氧化應激處理導致斑馬魚的脂質代謝出現異常。與其他組比較，模型組中TG 含量顯著升高（P ＜0.05）；與模型組相比，經過低、中、高濃度肽處理后TG含量均有所下降，且高劑量組肽處理后效果最佳，降至1.03 mmol／g prot，與對照組差異不顯著（P ＜0.05）。模型組的TC、LDL －C、HDL －C 顯著低于（P ＜0. 05）對照組。經BRKBPAPC 處理后TC、LDL－C、HDL －C逐漸恢復正常水平，隨著BRKBPAPC濃度增加，恢復效果越好。高劑量組與VC 組差異不顯著。經高劑量BRKBPAPC 處理后TC、LDL － C、HDL－C分別增至0.65、0.063、0.444 mmol／g prot。

王越［36］研究發現苦蕎蛋白抗氧化肽組分（TBPH－Ⅱ）具有較強的體外抗氧化活性，能有效改善肝細胞的氧化應激，顯著提高（P ＜0.05）SOD、CAT酶活力，同時還能調節肝細胞脂質代謝異常。賈槐旺［37］研究發現經分離純化后的紫蘇抗氧化肽組分G2 可以提高小鼠體內多種抗氧化酶能力，保護身體免受自由基的損害，并調節高脂血癥小鼠的脂質代謝異常。本研究結果與前人研究結果一致［36，37］，BRKBPAPC可提高斑馬魚體內多種抗氧化酶活力，同時還可調節斑馬魚由氧化應激引起的脂代謝異常。長期氧化應激引起肝臟受損，肝功能受損后肝臟對斑馬魚體內總膽固醇的合成能力減弱，導致總膽固醇數值降低，肝功能異常也會引起低密度脂蛋白偏低，導致體內脂代謝異常。而用BRKBPAPC處理組的各指標顯著提高，BRKBPAPC 能保護機體免受氧化損傷危害，保持正常脂代謝水平。

2.3 英國紅蕓豆抗氧化肽組分對斑馬魚行為學的影響

行為學檢測是一種比較經濟、便捷和有效的方法，是研究斑馬魚行為活躍程度的有效手段。行為學實驗研究參數包括每條魚處于不活動，低速、高速運動距離、運動次數以及運動時間，以斑馬魚移動速度＜1 cm／s記為不活動移動，移動速度1 ～10 cm／s記為低移速，移動速度＞10 cm／s 記為高移速。

斑馬魚處于不活動計數次數、累計時長及運動距離結果如圖7 ～圖9 所示。隨著處理時間增加，模型組處于不活動計數次數顯著增加（P ＜0.05），移動速度及距離顯著降低（P ＜0.05），經過低、中、高BRKBPAPC 處理后，斑馬魚處于不移動計數次數顯著降低（P ＜0. 05），且高劑量BRKBPAPC 效果最佳。

圖7 BRKBPAPC 對斑馬魚處于不活動計數的影響

圖8 BRKBPAPC對斑馬魚處于不活動移動時長的影響

圖9 BRKBPAPC 對斑馬魚處于不活動移動距離的影響

斑馬魚處于低速活動計數次數、累計時長及運動距離結果如圖10 ～圖12 所示。隨著處理時間增加，模型組處于低速移動次數顯著增加（P ＜0.05），低速移動速度及距離顯著降低（P ＜0.05），經過低、中、高BRKBPAPC 處理后，斑馬魚處于低速移動計數次數顯著增加（P ＜0.05），且高劑量BRKBPAPC 效果最佳。

圖10 BRKBPAPC對斑馬魚處于低移速計數的影響

圖11 BRKBPAPC對斑馬魚處于低移速時長的影響

圖12 BRKBPAPC對斑馬魚處于低移速距離的影響

斑馬魚處于高速活動計數次數、累計時長及運動距離結果如圖13 ～圖15 所示。隨著處理時間增加，模型組處于高速移動次數、移動速度及距離顯著降低（P ＜0.05），經過低、中、高BRKBPAPC 處理后，斑馬魚處于高速移動計數次數顯著增加（P ＜0.05），且高劑量BRKBPAPC 效果最佳，高劑量BRKBPAPC效果優于VC。

圖13 BRKBPAPC 對斑馬魚處于高移速計數的影響

圖14 BRKBPAPC對斑馬魚處于高移速時長的影響

圖15 BRKBPAPC 對斑馬魚處于高移速距離的影響

與其他組相比，模型組高速運動距離、運動時間和運動次數顯著降低，說明幼魚活動減少，行為受抑制，經過低、中、高劑量組BRKBPAPC 處理后，斑馬魚處于不活動狀態次數降低，處于低、高速狀態次數顯著增高，且成濃度依賴關系，高劑量肽處理后斑馬魚運動活潑，主要以慢速和快速游動為主。低、中劑量組運動速度、運動時間和次數稍微減少。

各組斑馬魚行為軌跡如圖16 所示，其中白色軌跡表示速度＜1 cm／s，紅色軌跡表示速度＞10 cm／s，綠色軌跡表示速度介于1 ～10 cm／s之間。

圖16 BRKBPAPC處理對斑馬魚行為軌跡的影響

由圖16 可知，模型組隨著處理時間的延長，斑馬魚不活潑，觸壁反射活動減少，行為軌跡變短，說明AAPH引起斑馬魚氧化應激，對運動行為有明顯的抑制作用。經過BRKBPAPC 處理后斑馬魚變得活潑，軌跡增多，說明BRKBPAPC 可有效改善氧化應激引起的斑馬魚的行為減弱。

王楊等［38］研究發現，氧化應激可導致斑馬魚TC與TG濃度顯著升高，斑馬魚自主運動活力抑制，對聲光刺激敏感程度顯著下降。楊亞楠等［39］研究發現氧化應激斑馬魚的運動軌跡明顯減少，運動總距離和運動速度均顯著下降（P ＜0.05），經二甲基姜黃素、黃芩苷和紫檀茋處理后斑馬魚運動軌跡及運動速度均有提高。本研究結果與前人研究結果一致［38，39］，氧化應激引起斑馬魚運動行為減弱，運動軌跡減少，BRKBPAPC 處理后斑馬魚運動軌跡及運動速度均有提高。但目前有關抗氧化肽對斑馬魚行為影響的研究較少。

3 結論

BRKBPAPC 具有良好的體內抗氧化活性，能提高斑馬魚體內多種抗氧化酶活力，減少有害物質MDA 的累積，同時具有調節斑馬魚體內脂代謝能力。在行為學研究中發現，BRKBPAPC 對斑馬魚的運動行為有明顯促進作用。高劑量的BRKBPAPC 對AAPH 誘導的氧化應激斑馬魚體內各指標起到了顯著的改善作用。初步探討了BRKBAPC 的體內抗氧化作用，為英國紅蕓豆蛋白功能性成分的開發與利用提供依據。