玉米芯功能性低聚糖分級純化及抗氧化活性研究

孫元琳，白宇仁，蔡文強，劉 瑞，王曉聞

（運城學院生命科學系1，運城 044000）

（農產品加工與質量安全運城市重點實驗室2，運城 044000）

（山西農業大學食品科學與工程學院3，太谷 030801）

玉米芯是玉米加工過程中的主要副產物，其不溶性膳食纖維含量非常高，主要為阿拉伯木聚糖［1］。玉米芯中還含有豐富的酚酸類物質。Torre 等［2］研究表明，玉米芯中含有的酚酸物質主要是阿魏酸和對香豆酸。玉米芯中含有質量分數1.4%的阿魏酸，其阿魏酸質量分數高于麥麩（0.4% ～0.7%）、蔗渣（1.0%）、小麥秸稈（1.2%）等，是農業副產品中較具潛力的阿魏酸資源［3］。利用木聚糖酶酶解玉米芯不溶性膳食纖維，可作用于阿拉伯木聚糖鏈的β －1，4糖苷鍵，會產生功能性阿魏酰低聚糖（FOs），和阿拉伯低聚木糖（AXOs）［4］。

功能性低聚糖是由2 ～10 個單糖分子通過糖苷鍵連接形成，屬于直鏈或支鏈的低度聚合糖［5］，具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌、調節腸道菌群結構等功能［6］。FOs和AXOs作為新型的益生元，可以特異性地促進雙歧桿菌等益生菌的增殖，還可以通過發揮抗氧化作用調節腸道菌群結構，增強機體免疫力，效果優于低聚果糖［7］。FOs兼具阿魏酸和低聚木糖的功能特性，且因結構中特殊的酯鍵，增加了阿魏酸的水溶性，更有利于發揮其抗氧化作用［9］。目前，FOs 和AXOs因其獨特的生理功效引起了越來越多學者的關注。本實驗采用活性炭柱層析對玉米芯功能性低聚糖酶解液進行分離純化，對其組成、理化性質和抗氧化活性進行分析，以期為玉米資源的綜合利用和有效增值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米芯：山西省太谷縣，大豐30；活性炭：市售。

木糖、阿拉伯糖、阿魏酸標準品、2，2 －聯氮－二（3 －乙基－苯并噻唑－6 －磺酸）二銨鹽、50%氫氧化鉀溶液、氫氧化鈉溶液、DPPH（分析純）；木聚糖酶EC3.2.1.8 酶活（60 000 U／mg）；甲醇、冰乙酸、異丙醇、溴化鉀（色譜純）。

1.2 儀器與設備

Z系列層析柱，BS － 100A 自動部分收集器，DHL－A型電腦恒流泵，Cary5000 紫外－可見－近紅外分光光度計，LC1200 型高效液相色譜儀，TENSOR27 型傅里葉變換紅外光譜儀，ICS 1100 型離子色譜儀，FreeZone2.5 型冷凍干燥機。

1.3 實驗方法

1.3.1 玉米芯功能性低聚糖酶解液分級純化

酶解：利用木聚糖酶對玉米芯不溶性膳食纖維進行酶解，具體條件為：加酶量89.7 mg／L、酶解時間16 h、底物質量濃度111 g／L、pH 3.65、酶解溫度53℃。酶解結束后于沸水浴中滅酶10 min，加入3 倍體積無水乙醇，4 ℃下醇沉過夜，之后3 000 r／min離心15min，所得上清液為玉米芯功能性低聚糖酶解液。

分級純化：玉米芯不溶性膳食纖維酶解液上樣量10 mL，加入到已經平衡好的活性炭柱（26 ×300 mm）中，依次用脫氣蒸餾水和不同梯度的乙醇溶液（體積分數10%、20%、40%、60%、80%）洗脫，流速控制為1.5 mL／min，自動部分收集器以4 mL／管收集，用苯酚－硫酸法隔管在線檢測總糖含量，直至檢測不到糖為止，繪制洗脫曲線。

1.3.2 低聚糖聚合度分析

低聚糖檢測條件：色譜柱CarboPac PA200；檢測器為電化學檢測器；柱溫30 ℃；150 mmol／L NaOH溶液等度洗脫；流速0.4 mL／min；進樣體積25 μL。通過比較樣品圖譜與標準品（阿拉伯糖、木糖、低聚木糖）的相對保留時間，進而判斷低聚糖聚合度。

1.3.3 單糖組成分析

將待測樣品溶于4 mol／L 三氟乙酸，121 ℃酸水解2 h。N2吹干后，加30 mL 超純水溶解，進樣離子色譜。檢測條件：CarboPac PA 200 色譜柱；檢測器為電化學檢測器；柱溫30 ℃；10 mmol／L KOH 溶液進行等度洗脫；流速0.4 mL／min；進樣體積25 μL。通過比較樣品離子色譜圖與單糖標準品的相對保留時間，來判斷樣品中單糖種類，依據峰面積的比值確定樣品單糖組成的量比。A／X 為阿拉伯糖與木糖的摩爾比值。

1.3.4 阿魏酰基團檢測

分別提取各洗脫組分中游離態阿魏酸和結合態阿魏酸，用HPLC進行檢測。

游離阿魏酸提取：水洗和醇洗脫組分→乙酸乙酯萃取（3 次）→有機溶劑蒸干→1 mL甲醇復溶。

結合阿魏酸提取：萃取后的水相→2 mol／L NaOH酯解→40 ℃恒溫振蕩過夜→離心→調酸→濃縮→萃取→蒸干→甲醇復溶［11］。

色譜條件：色譜柱C18 柱（4. 6 mm ×150 mm，5 μm）；流動相：甲醇－2%乙酸；流速1.0 mL／min；檢測波長：320 nm；柱溫：室溫；進樣量10 μL；運行時間為1 h。

1.3.5 紫外光譜掃描

將待測樣品溶于MOPS 緩沖液中，在220 ～400 nm波長范圍內進行紫外光譜掃描。

1.3.6 紅外光譜掃描

稱取約2 mg的樣品與KBr混合壓片，于4 000 ～400 cm－1范圍內進行紅外光譜測試。

1.3.7 DPPH·清除能力測定

參照郭剛軍等［12］的方法。將2 mL 不同濃度的3 種樣品溶液與2 mL 0.2 mmol／L DPPH乙醇溶液充分混合，室溫避光放置30 min 后，于517 nm 處測定吸光度值。按式（1）計算。

式中：Ai為2 mL DPPH乙醇溶液＋2 mL 樣液的吸光值；Aj為2 mL 無水乙醇＋2 mL 樣液的吸光值；Ac為2 mL 無水乙醇＋2 mL DPPH 乙醇溶液的吸光值。

1.3.8 ·OH清除能力測定

參照Lee等［13］方法。吸取9 mmol／L FeSO4溶液2mL，9 mmol／L水楊酸乙醇溶液2 mL，不同濃度的樣品溶液2 mL，置于比色管中，搖勻，加入2 mL 8. 8 mmol／L H2O2溶液，置于37 ℃水浴鍋中恒溫水浴30 min，于510 nm處測定吸光度值。按式（2）計算。

式中：Ai為樣品吸光值；Aj為用蒸餾水代替H2O2的吸光值；Ac為用蒸餾水代替樣液的吸光值。

1.3.9 ABTS＋·清除能力測定

參照Kwon 等［14］的方法。分別配制7 mmol／L ABTS溶液和2.45 mmol／L 過硫酸鉀溶液。將兩者等體積混合，室溫避光放置16 h。準確吸取0.1 mL樣液，加入3. 9 mL ABTS 溶液，室溫避光放置10 min，于734 nm處測其吸光度值。按式（3）計算。

式中：Ai為0.1 mL 樣液＋3.9 mL ABTS 樣液的吸光值；Aj為0.1 mL 樣液＋3.9 mL 蒸餾水的吸光值；Ac為0.1 mL 蒸餾水＋3.9 mL ABTS 溶液的吸光值。

1.3.10 脂質過氧化抑制能力測定

參照田敏等［15］方法。向比色管中依次加入0.5 mL 10 g／100 mL 蛋黃勻漿液、0. 5 mL 樣品溶液、0.07 mol／L FeSO4，充分混勻，于37 ℃下水浴30 min。取出后加入1.5 mL 體積分數10%三氯乙酸溶液和1.5 mL體積分數0.8%硫代巴比妥酸溶液，沸水浴20 min，冷卻后，離心10 min（3 000 r／min），取上清液于532 nm處測吸光度值。按式（4）計算。

式中：Ai為樣品吸光值；Aj為未添加硫代巴比妥酸的樣品反應液吸光值；Ac為用蒸餾水代替樣液的吸光度值。

1.4 數據分析

所有實驗均重復3 次，結果表示為平均值±標準差，運用Excel 和SPSS 軟件對實驗數據進行統計分析，采用Origin8.6 軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 活性炭柱層析洗脫曲線

采用活性炭柱層析對玉米芯功能性低聚糖酶解液（EH）進行梯度洗脫，洗脫曲線如圖1 所示。EH 經分離得到6 個洗脫峰，分別為水洗脫組分（WO）、體積分數10%乙醇洗脫組分（EO －10）、體積分數20%乙醇洗脫組分（EO －20）、體積分數40%乙醇洗脫組分（EO －40）、體積分數60%乙醇洗脫組分（EO －60）、體積分數80%乙醇洗脫組分（EO －80）。

2.2 低聚糖聚合度分析

采用離子色譜對活性炭柱層析洗脫組分的低聚糖聚合度進行檢測，其中各洗脫組分中低聚糖的含量如表1 所示。WO組分主要由DP2、DP3 和DP4 構成，EO－10 組分主要由DP2 和DP3 構成，EO－20 組分主要由DP2、DP3 和DP4 構成。EO －40、EO －60和EO－80組分不僅含有聚合度較低的低聚糖（DP2 ～DP4），還含有聚合度更高的低聚糖。隨著乙醇濃度的升高，DP2 和DP3 的含量逐漸降低，而DP5 和DP7的含量逐漸升高。研究結果表明，低聚糖聚合度越高所需洗脫的乙醇濃度也就越高。

表1 活性炭柱層析洗脫組分的低聚糖組成

2.3 單糖組成分析

WO和EO的單糖組成如表2 所示。WO、EO 的單糖均由木糖和阿拉伯糖組成，且木糖是主要的單糖組成成分，另外還含有少量的葡萄糖和半乳糖。WO中各單糖摩爾比為Ara∶Xyl∶Glc∶Gal ＝1.00∶1.86∶0.17∶0.13，分支度A／X ＝0.54；EO中各單糖的摩爾比為Ara∶Xyl∶Glc∶Gal ＝1.00∶3.12∶0.19∶0.12，分支度A／X ＝0.32。WO 較高的分支度更有利于阿魏酰基團連接在阿拉伯糖殘基上。

表2 活性炭柱層析洗脫組分的低聚糖組成

2.4 阿魏酰基團檢測

通過HPLC對活性炭水洗脫組分和醇洗脫組分中的游離態及結合態阿魏酸進行檢測。由圖2 可以看出，水洗脫組分WO 中的阿魏酸主要以結合態形式存在，而游離態形式阿魏酸未檢出（圖略）；醇洗脫組分EO 中的游離態和結合態阿魏酸均未檢出（圖略），表明醇洗脫組分EO 中不含阿魏酰基團。

圖2 水洗脫組分（WO）結合態阿魏酸HPLC圖譜

2.5 紅外光譜分析

采用傅里葉變換紅外光譜對洗脫組分進行檢測，結果如圖3 所示。WO和EO均具有糖類物質的特征吸收峰，3 200 ～3 600 cm－1出現的寬峰是O—H伸縮振動吸收的結果，2 925 cm－1附近出現的吸收峰是由于糖類的C—H伸縮振動引起的，1 200 ～1 400 cm－1的一組峰屬于糖類C—H 的變角振動。897 cm－1附近的吸收峰，是吡喃糖β－型C—H變角振動的特征吸收峰。WO 在1 735 cm－1附近出現的吸收峰是酯鍵的特征吸收峰，表明WO 中阿魏酸酯的存在。而EO在1 735 cm－1不存在明顯的吸收峰，表明樣品中不含阿魏酰基團。

圖3 水洗脫組分（WO）和醇洗脫組分（EO）紅外光譜圖

2.6 紫外光譜分析

分別對標準品阿魏酸（FA）、活性炭水洗組分WO及醇洗組分EO 進行紫外波長掃描，結果如圖4所示。阿魏酸標準品在286 nm附近有最大吸收峰，而WO在325 nm附近有最大吸收值，由此推斷WO中含有結合態阿魏酸。而EO 在286 nm 和325 nm處均未出現明顯吸收峰，表明EO 中不含阿魏酰基團。此結果與阿魏酰基團檢測、單糖組成和紅外光譜分析結果相符合。

圖4 水洗脫組分（WO）和醇洗脫組分（EO）紫外波長掃描圖

2.7 抗氧化活性

2.7.1 DPPH·清除能力

酶解組分EH、純化組分WO、EO對DPPH·清除能力如圖5 所示。3 種不同組分均對DPPH·有不同程度的清除作用。當樣品質量濃度為10 mg／mL時，EH的清除率可達到87.29%、經純化后WO 可以達到92.29%、EO 為73.59%，其清除能力強弱依次為WO ＞EH ＞EO。酚酸抗氧化劑可以通過酚羥基的O－H鍵直接斷裂給出氫原子，清除DPPH·，還可以直接將電子轉移給DPPH·，轉化為反應活性低的陰離子［17］。WO和EO相比，WO的DPPH·清除能力強于EO，是因為WO 結構中含有結合態阿魏酸，抗氧化活性較高，然而EO 結構中不含結合態阿魏酸，因此清除率較低。

圖5 酶解組分及其純化組分對DPPH·的清除能力

2.7.2 ·OH清除能力

酶解組分EH、純化組分WO、EO 對·OH 清除能力如圖6 所示。實驗采用的是Fenton反應體系，3 種不同組分均具有清除·OH 的能力，且呈劑量效應關系，當樣品質量濃度為10 mg／mL 時，WO 清除能力最強為91.54%，EH 次之為47.75%，EO 清除能力最弱為40.47%。EH和WO具有清除羥基自由基的作用與結構中阿魏酸的存在密切相關［18］。阿魏酸苯環上的給電子基團能有效終止自由基鏈式反應，而EO結構中含有大量活性羥基，羥基是活潑的氫供體，氫離子可以為自由基提供電子，生成穩定的碳自由基和水，從而起到清除·OH的作用，但相對于WO，其清除能力較低［19］。

圖6 酶解組分及其純化組分對·OH的清除能力

2.7.3 ABTS＋·清除能力

酶解組分EH、純化組分WO、EO清除ABTS＋·能力如圖7 所示。3 種不同組分對ABTS＋·均具有較強的清除作用，當樣品質量濃度為10 mg／mL時，EH的清除率達到85.92%，經純化后WO清除率最高為93.04%，EO 清除效果略弱為82.65%，其清除能力強弱依次為WO ＞EH ＞EO。EH 及其純化組份WO、EO均為多羥基化合物，羥基可以提供氫離子與ABTS＋·有效結合，從而起到消除ABTS＋·的作用。

圖7 酶解組分及其純化組分對ABTS ＋·的清除能力

2.7.4 脂質過氧化抑制能力

酶解組分EH、純化組分WO、EO 抑制脂質過氧化能力如圖8 所示。酶解組分EH、純化組分WO、EO均對脂質過氧化具有一定的抑制作用。當樣品質量濃度為1 ～6 mg／mL 時，EO 與EH、WO 相比相差較大；當樣品質量濃度＞6 mg／mL，三者相差較小，其清除能力強弱依次為WO ＞EH ＞EO。低聚糖結構中含有大量的羥基、羧基等活性基團可以直接作用于自由基，阻斷或減緩脂質過氧化的進行。阿魏酸結構中所含的羧基可以通過結合酚酸和脂質雙分子層，減少脂質過氧化的發生［20］。EO結構中不含阿魏酸，因此抑制脂質過氧化的能力低于WO。

圖8 酶解組分及其純化組分抑制脂質過氧化能力

3 結論

玉米芯酶解液（EH）經活性炭柱層析分離純化得到水洗脫組分（WO）和不同濃度醇洗脫組分（EO）。WO 的低聚糖聚合度主要為DP2 ～DP4，EO－10、EO － 20 的低聚糖聚合度主要為DP2 和DP3，EO － 40、EO － 60 和EO － 80 組分不僅含有DP2 ～DP4，還含有聚合度更高的低聚糖。單糖組成表明，WO和EO主要由Ara和Xyl組成，分支度A／X分別為0.54 和0.32。WO含有結合態阿魏酸，為阿魏酰阿拉伯低聚木糖；而EO 不含阿魏酸，為阿拉伯低聚木糖。EH及其純化組分WO、EO均具有一定的清除自由基（DPPH·、·OH、ABTS＋·）能力和抑制脂質過氧化能力，且WO抗氧化活性最高。結果表明，阿魏酰阿拉伯低聚木糖具有較強的抗氧化能力，且抗氧化活性主要來源于阿魏酰基團。