西藏高原糧油作物曲霉菌污染及菌株產毒力研究

魏 娜，張飛龍

（西藏自治區農牧科學院農業質量標準與檢測研究所，拉薩 850032）

曲霉屬真菌分布廣泛，是常見的食品、糧食、環境污染菌，能在適宜的條件下代謝產生對動物和人類具有致病性的次級代謝產物［1－3］。例如由黃曲霉菌（Aspergillus flavus）和寄生曲霉菌（Aspergillus parasiticus）等產生的次生代謝物黃曲霉毒素（AFB1），具有劇毒和強致癌性，國際癌癥研究機構將其列為一級致癌物［4，5］；赭曲霉菌（Aspergillus ochraceus）產生的赭曲霉毒素（OTA）具有較強的腎毒性、肝毒性、神經毒性和免疫毒性，能夠致癌、致畸、致突變，國際癌癥研究機構和世界衛生組織將其列為2B 類致癌物［6，7］；雜色曲霉（Aspergillus uersicolor）和構巢曲霉（Aspergillus nidulans）產生的雜色曲霉毒素（ST）基本結構與黃曲霉毒素十分相似，毒性也僅次于黃曲霉毒素，國際癌癥研究機構將其歸類為2B 類致癌物。為防止真菌毒素對人體的危害，GB 2761—2017《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》規定小麥、大麥、其他谷物及其制品中黃曲霉毒素B1（AFB1）、OTA均不得超過5 μg／kg，花生中AFB1不得超過20 μg／kg。歐盟食品安全局（EFSA）于2013 年6 月7日發布了食品和飼料中的雜色曲霉毒素對公眾的健康風險意見［8－10］。

真菌污染是制約糧油產業發展和出口貿易的主要危害因子。目前，國內已有許多學者報道我國糧油作物受黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、雜色曲霉毒素等多種曲霉菌毒素污染［11－17］。目前國內外對曲霉屬產毒菌分布、產毒能力也做了大量研究。Cotty［18］發現農產品容易被黃曲霉菌侵染產生黃曲霉毒素，產AFB的量和類型是由基質、環境和菌株共同決定的。Cotty等［19］發現黃曲霉菌數量隨著地區溫度升高而增加，隨著緯度升高反而減少，且其產毒能力具有明顯的地域差異特征。Daou 等［20］研究表明，真菌產毒力也受氣候條件影響。西藏高原具有獨特的高原生態類型，對研究曲霉毒菌及其毒素污染發生消長變化規律與預警防控等具有重要意義，但有關研究鮮有報道。因此，實驗連續5 年開展西藏地區不同類型作物曲霉菌毒素污染評估，通過對西藏糧油樣品中曲霉菌分離、鑒定以及黃曲霉菌株產毒力差異分析研究，探明西藏曲霉菌污染發生與污染分布特征，為西藏糧油作物曲霉毒素污染多維預警與精準防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

青稞和小麥樣品采集：連續5 年分別從西藏拉薩市、山南市、日喀則市、林芝市、昌都市、阿里地區采集麥類作物樣品共計1 131 份，其中2017 年750份，2018 年149 份，2019 年191 份，2020 年150 份，2021 年151 份。

花生樣品采集：連續5 年從西藏林芝市采集花生樣品共計144 份，其中2017 年24 份，2018 年48份，2019 年24 份，2020 年24 份，2021 年24 份。

1.2 方法

1.2.1 籽粒樣品真菌毒素檢測方法

青稞、小麥、花生籽粒晾干磨碎后，稱取5 g樣品（精確到0.02 g），加入10 mL 水充分浸潤后，再加入10 mL 的V甲酸∶V乙腈（1∶9）溶液，室溫下搖床1 h。加入QuEChERS鹽包，5 000 g轉速下離心5 min。玻璃纖維紙過濾后吸取1 mL 樣品濾液直接加入SPE 小柱，待流干后加入0.5 mL乙腈洗脫，吹干，收集全部流出液。乙腈水溶液（體積比1∶1）定容到1 mL，過0.22 μm有機濾膜后，采用高效液相色譜法測定真菌毒素含量。色譜條件為：色譜柱為Eclipse XDB － C18（5 μm，4.6 mm ×150 mm）；柱溫為35 ℃；流動相為V甲醇∶V水（40∶60）；流速為0.7 mL／min；采用柱后光化學衍生法：光化學衍生器254 nm；以熒光檢測器檢測，激發波長360 nm，發射波長440 nm，進樣量10 μL。

1.2.2 曲霉菌的分離、純化與鑒定

取10 g樣品，加入90 mL滅菌水，在室溫用渦旋振蕩器振蕩30 min，制成0.1 g／mL樣品菌懸液；再取0.1 g／mL樣品菌懸液加入9 mL無菌水試管中，制備出0.01 g／mL 稀釋度的懸浮液。每個稀釋度取50 μL菌液，涂布在PDA培養基上［14］，霉菌培養箱內28℃培養5 d，每個稀釋度重復2 次。經形態學初步觀察后進行分離純化，直至得到單個菌落進行ITS（Internal Transcribed Spacer）分子生物學鑒定。引物序列為ITS1：5’－ TCCGTAGGTGAACCTGCGG － 3’，ITS4：5’－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3’。

1.2.3 產毒菌株培養與測毒

將鑒定獲得的黃曲霉菌株在察氏培養基上培養，在真菌培養箱內28 ℃黑暗培養7 d 后，用含0.1%（體積分數）的吐溫無菌水將孢子從培養基上沖洗下來，制備黃曲霉菌孢子液備用。將制備好的黃曲霉分生孢子液在光學顯微鏡下用血球計數板計數，將孢子液的濃度定為1.5 ×107個／mL。加30 mL沙氏液體培養基于100 mL 錐形瓶中，加入1 mL 孢子液，在搖床內以200 r／min速率28 ℃培養7 d后過濾收集菌絲，裝入5 mL 凍存管放置凍干機2 d。凍干后準確稱取50 mg菌絲，加入甲醇－乙腈－水溶液（體積比2∶2∶1），放入研磨儀中研磨后，50 ℃超聲10 min，離心取上清液，上清液加入甲醇－二氯甲烷－乙酸乙酯溶液（體積比1∶1∶1），再次50 ℃超聲10 min后，離心取上清液，過0.22 μm有機濾膜后，采用高效液相色譜法測定真菌毒素含量。色譜條件同1.2.1。

1.2.4 超標率判定

參照GB 2761—2017，青稞和小麥中AFB1、OTA限量值為5. 0 μg／kg?；ㄉ蠥FB1限量值為20 μg／kg。GB 2761—2017 未規定毒素限量值的，本實驗不做判定。

2 結果與分析

2.1 西藏主要農作物曲霉屬真菌污染研究

選取204 份樣品（135 份青稞，57 份小麥，12 份花生樣品），以PDA為分離培養基，通過形態學和分子生物學鑒定，共分離出15 種411 株曲霉菌，其中32 份青稞樣品受到曲霉菌污染，樣品的感染率為23.70%；9 份小麥樣品受曲霉屬真菌污染，樣品感染率為15.79%；8 份花生樣品受曲霉屬真菌污染，樣品感染率為66.67%。411 株曲霉菌中，6 株菌株未能鑒定到種，其他菌株分別為：A. amstelodami、A. aryzae、A. awamori、A. chevalieri、A. costaricaensis、A. cristatus、A. flavus、A. fumigatus、A. minisclerotigenes、A. nidulans、 A. niger、 A. rugulosus、 A. tubingensis、A. unguis、A. ustus。表1 可見，青稞共中分離到11 種曲霉菌，主要是菌種為A. flavus、A. niger、A. tubingensis；小麥中分離到8 種曲霉菌，其主要菌種為：A. amstelodami、A. niger、A. tubingensis；花生種分離到曲霉菌的僅有A. aryzae、 A. flavus、A. minisclerotigenes 3 種曲霉菌。A. flavus 是青稞、小麥、花生共有的污染菌。青稞、小麥中優勢種均為A.niger，分離頻度分別為65.33%、31.25%?；ㄉ鷥瀯莘N為A. flavus，就花生不同部位而言，分離到的82%黃曲霉菌來自花生殼，18%來自花生仁。

表1 西藏不同農作物曲霉菌種類及百分比

2.2 西藏不同農作物真菌毒素污染研究

由表2 可見，2017—2021 連續5 年對西藏糧油作物（青稞、小麥、花生）中6 種主要真菌毒素污染進行監測，結果表明西藏青稞、小麥、花生真菌毒素污染相對較輕。

表2 西藏不同作物不同年限真菌毒素污染率／%

污染西藏麥類作物的真菌毒素主要為雜色曲霉毒素，其次為赭曲霉毒素，二者連續5 年均有檢出，雜色曲霉毒素檢出率范圍為1.31% ～10.74%，赭曲霉毒素檢出率范圍為0.56% ～4.70%，超標率范圍為0.00% ～3.36%。麥類作物種4 種黃曲霉毒素污染較輕，僅2017、2018、2020 年有檢出，且僅有1 種黃曲霉毒素檢出，檢出率最高為2.68%，超標率最高為2.01%，AFB1檢出量最高為29.67 μg／kg，AFB2檢出量最高為23. 10 μg／kg，AFG2檢出量最高為43. 16 μg／kg。

花生樣品僅有黃曲霉毒素污染，2017 年24 份花生樣品中僅有1 份樣品黃曲霉毒素有檢出，AFB1含量為38.67 μg／kg，AFB2含量為8.77 μg／kg，黃曲霉毒素總含量為47.44 μg／kg，AFB1檢出率和超標率均為4.17%；AFG1、AFG2均未檢出；2018 年48 份樣品中僅有1 份樣品黃曲霉毒素有檢出，AFB1含量為58.44 μg／kg，AFB2含量為8.69 μg／kg，黃曲霉毒素總含量為67.13 μg／kg，AFB1、AFB2檢出率和超標率均2.08%。2019—2021 年24 份樣品中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2均未檢出。

2.3 不同黃曲霉菌株產毒力差異研究

對分離得到的60 余株黃曲霉菌株進行產毒力檢測，結果表明，西藏高原不同黃曲霉菌株產AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、黃曲霉總量（AFT）含量范圍分別為0.0 ～35 050.5 μg／kg、0.0 ～4 232.9 μg／kg、0.0 ～19.2 μg／L、0.0 ～7.7 μg／kg、0.0 ～39 310.3 μg／kg；平均含量分別為3 534.2、447.7、2.2、1.2 μg／kg。其中青稞中黃曲霉菌株產AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的平均含量分別為1 531.56、85.38、0.00、0.03 μg／kg；小麥中黃曲霉菌株產AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的平均含量分別為6 409.76、426.14、0.00、0.02 μg／kg；花生中黃曲霉菌株產AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的平均含量分別為665.92、953.55、4.90、4.49 μg／kg。西藏高原黃曲霉菌株產AFB1和AFB2毒素能力較強，產AFG1和AFG2毒素能力較弱，表3 相關分析表明，西藏菌株產AFB1含量與AFB2顯著正相關，相關系數為0.508；產AFG1含量與AFG2顯著正相關，相關系數為0.822；B族毒素與G族毒素整體呈負相關。

表3 不同類型黃曲霉毒素含量相關性

從麥類作物分離的所有黃曲霉菌株均能產黃曲霉毒素。其中產AFB1黃曲霉菌株數量最多，占總菌株數量98.11%，其次為AFB2菌株，占所有菌株數占總菌株數量的66.04%，產AFG1、AFG2菌株數量最少，分別為33.96%、20.75%。圖1 可見，產毒菌株按照檢測到的毒素種類分為6 種：只產AFB1，只產AFG1，只有AFB1和AFB2，只產AFB1和AFG1，產AFB1、AFB2、AFG1，產AFB1、AFB2、AFG2，產AFB1、AFG1、AFG2，有AFB1、AFB2、AFG1、AFG2。產毒菌株以產AFB1、AFB2為主，占所有菌株47.17%；其次是只產AFB1、AFG2菌株，占比16.98%；只產AFB1菌株占所有菌株的11.32%；4 種毒素都產的菌株占比為9.43%；其他4 種類型產毒菌株占比為1. 89% ～3.77%。

圖1 黃曲霉菌株產毒類型

從花生分離出的所有黃曲霉菌株均能產黃曲霉毒素。其中產AFB1黃曲霉菌株數量最多，占總菌株數量94.44%，其次為產AFG2菌株和AFB2菌株，分別占所有菌株數占總菌株數量的77.78%、72.22%，產AFB2菌株數量最少，為61.11%。圖1 可見，產毒菌株按照檢測到的毒素種類分為6 種：只有AFB1，只有AFB1和AFG2，只有AFB2、AFG2，有AFB1、AFB2、AFG1，有AFB1、AFB2、AFG2，有AFB1、AFB2、AFG1、AFG2。產毒菌株以產AFB1、AFB2、AFG1、AFG2為主，占所有菌株55.56%；其次是只產AFB1菌株，占比16.67%；只產AFB1和AFG2黃曲霉菌株占所有菌株的11.11%，其他3 種類型產毒菌株各占5.56%。

為進一步研究黃曲霉毒素的產毒能力的大小，本研究根據菌株產黃曲霉毒素含量，將其產毒能力劃分為4 個等級：高產毒菌（＞1 000 μg／kg）、中產毒菌（100 ～1 000 μg／kg）、低產毒菌（0 ～100 μg／kg）和不產毒菌（ND）。

如表4 所示，麥類作物低產AFT 菌株占32.07%，中產AFT 菌株占33.95%，高產AFT 菌株僅占22.64%?；ㄉ彤aAFT菌株占44.45%，高產AFT菌株占44.44%，中產AFT 菌株僅占11.12%。雖然麥類作物高產毒菌株比例低于花生，但產毒量5 000 μg／kg的麥類作物占比16. 80%，花生為0.00%。

表4 西藏黃曲霉菌株產毒力分布

3 討論

本研究發現污染西藏麥類作物的真菌毒素主要為雜色曲霉毒素，其次為赭曲霉毒素，但本研究中并未分離到產雜色曲霉的常見菌株雜色曲霉和構巢曲霉及產赭曲霉毒素的赭曲霉菌株，分離出大量黑曲霉（A.niger），黑曲霉曾作為食品級安全的“微生物細胞工廠”，被美國食品藥品監督管理局認定為一般安全可靠無毒的微生物［21－23］，但現在越來越多研究表明黑曲霉能夠產出對人體有毒害作用的赭曲霉毒素［24－30］，西藏糧油作物中赭曲霉毒素污染是否來源A.niger菌株，值得進一步研究。

西藏高原花生產地位于西藏林芝市察隅縣，屬亞熱帶河谷氣候。冬暖夏熱，常年濕潤多雨，年平均降雨量為1 000 mm，年平均相對濕度69%，溫濕度比較適宜于黃曲霉生長，本研究中也分離到較多的黃曲霉菌，多數來自花生殼，花生殼比花生仁更易感染黃曲霉菌，這可能是因為莢殼是抵御黃曲霉菌侵染的第一道防線［31］。這些黃曲霉菌適宜溫濕度黑暗培養環境下，100%黃曲霉菌株都產AFT，且菌株產毒能力相當高，但西藏高原花生樣品中黃曲霉毒素污染率較低，僅為0.00% ～4.17%。探究高產毒真菌在西藏高原相對適宜溫濕度條件下污染率較低的原因，在溫濕度因子研究基礎上，進一步增加紫外輻射、光照時間、氧氣含量、晝夜溫差等高原氣候因子研究產毒真菌產毒機制對于推進真菌毒素高效防控具有重要意義。

據報道，黃曲霉只能產生B 族黃曲霉毒素，而不能產生G族黃曲霉毒素［32］，但也有研究表明黃曲霉能產生B族和G族毒素［33－35］。朱婷婷等［34］研究結果顯示，黃曲霉菌主要以產B 族毒素為主，具有產毒能力的菌株一定會產生危害性極大的AFB1毒素；周飄［35］研究也表明能產G 族毒素的黃曲霉菌株一定能產B族毒素。本研究結果表明西藏高原花生中黃曲霉菌株同樣是產B 族毒素能力較強，平均含量比G族毒素含量高100 多倍，但本研究分離到產G 毒素卻不產B 毒素這一特殊菌株，在前期研究中也發現僅有AFG2毒素污染，沒有其他種類黃曲霉毒素污染的現象［16］，高原環境下產毒真菌毒素發生及代謝途徑是否與平原環境不一致，高海拔地區產毒真菌代謝合成途徑及產物以及產毒菌株基因組學等有待進一步研究。此外，菌株檢測到產生不同種類毒素究竟是菌株自身產毒能力的差異還是代謝轉化的結果需進一步研究確證。

本研究在檢測黃曲霉菌株產毒力時，先采用濾液－孢外產毒法，結果顯示26.4%黃曲霉菌株不產毒，為進一步核實又采用菌絲－孢內產毒進行檢測，所有菌株都能產毒?？梢姴煌瑱z測方法對菌株產毒力影響很大，不同的培養基由于碳源、氮源及滲透壓的不同對菌株的產毒力也有影響［36，37］，目前國內僅有NY／T 2311—2013 規范了黃曲霉毒素孢外檢測方法，亟需研究制定孢內法測定菌株產毒能力的檢測標準，并規范不產毒菌株的定義。

4 結論

對西藏不同類型作物中曲霉屬菌污染情況研究表明，204 份樣品中，共分離出15 種曲霉菌，青稞樣品中曲霉菌污染率為23.70%；小麥樣品污染率為15.79%；花生污染率為66.67%。西藏高原不同作物污染優勢菌群并不相同。麥類作物青稞、小麥中曲霉屬優勢種均為A. niger，分離頻度高達65.33%，花生優勢種為A. flavus。污染西藏麥類作物的真菌毒素主要為雜色曲霉毒素，其次為赭曲霉毒素。分離的所有黃曲霉菌株均能產黃曲霉毒素，其中產AFB1黃曲霉菌株數量最多。