非轉基因法阿爾茲海默病動物模型的研究進展

吳殿秀，韓雨霖，袁依然，周姝婷，王海鵬 （北華大學基礎醫學院，吉林 吉林 132013）

阿爾茲海默病（Alzheimer's disease，AD）即老年癡呆癥，是一種中樞神經退行性病變。據世衛組織報道，目前有5500 萬人患有癡呆癥。在我國60 歲及以上老年人中有9.83 萬人患有阿爾茨海默病[1]。有學者推斷，到2050 年我國阿爾茨海默病患者將達到3003 萬人。隨著我國人口老齡化的發展進程，可以預見AD 將嚴重威脅老年人的生活質量和健康狀況，所以對AD 治療方法的研究迫在眉睫。筆者在檢索AD 造模相關文獻時發現，多數文獻來自國外，國內對于AD 模型的研究較少。所以本文充分比較不同AD 動物模型的優缺點，為科學研究者針對不同的實驗內容選取不同的動物模型提供確切的理論依據。

1 單點或多點注射β-淀粉樣蛋白寡聚體

注射點選擇在AD 主要發生病變的，且與記憶和學習息息相關的小鼠海馬的CA1 區和齒狀回區。注射物為β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）1-42和Aβ25-23形成的寡聚體。此模型最早在第7 天時出現氧化應激，神經元死亡以及突觸可塑性降低等病理變化，但由于未形成斑塊且其他病理特征較輕微，行為學特征不夠明顯故不能作為模型使用。該模型到2月齡時出現穩定的神經元丟失和淀粉樣沉積[2]。該造模方法有許多缺陷，首先注射手法和位置的選擇極其重要，容易傷及腦組織。其次通過注射帶來的病理學特征較為局限，病理特征僅局限于注射區，但對于某些藥物對單一區域影響的研究有較大價值。與此同時，關于AD 的發病機制，Aβ 沉積是否為關鍵環節還有待商榷，有研究顯示清除Aβ 斑塊并不會改善AD 患者的行為、認知等障礙，并且在無AD 老人腦中也會有Aβ 沉積。但這種造模方式也常用于誘導AD 動物模型聯合其他轉基因以及非轉基因方法造模。

2 Tau蛋白相關病理模型

注射蛋白有人工合成Tau 蛋白纖維和人源Tau蛋白兩種。微管相關蛋白Tau 是由6 種異構體組成的家族，在AD 患者腦內發生神經退行性變的神經元中異常過度磷酸化并積聚，正常Tau 與AD 過度磷酸化Tau（ADP-Tau）的亞型有特異性相互作用，其中Tau4L 與其結合能力最強[3]。從AD 腦中獲得的不溶性組分接種Tau 后，宿主Tau 對于注射Tau 的播種和擴散是強制性的，且Tau的播種和擴散是可變的基因型依賴的Tau 磷酸化和Tau 硝基化，MAP2 磷酸化和與異常Tau 沉積共定位的激酶的可變激活。在Tau的體外研究中顯示纖維性Tau 病理形成之前存在替代的Tau 聚集體，這些Tau 的分層寡聚形式也有助于神經變性[4]。Tau 注射時，由于小鼠本身含有的宿主Tau和注射區域的差異，對損傷的細胞以及產生沉積物的分子組成，均會產生影響。越來越多的證據表明，Tau 聚集物以朊病毒樣的方式傳播和復制，伴隨著病理性Tau 種子的攝取，導致受體細胞中單體Tau的錯誤折疊和聚集。國外的研究者將離心與洗脫法相結合，從AD腦內提取出Tau聚集物，并將該物質注射到小鼠的海馬和皮質區，3月齡時即在注射區檢測到磷酸化Tau蛋白，并且病理變化隨時間呈進行性發展[5]。在與人源Tau 相結合的和與人工Tau（Tau-磷脂復合物寡聚體）相結合的轉基因小鼠的比較中發現，人源Tau 蛋白模型會顯現出更加明顯的病理特征[6]。但人源AD 的獲取復雜困難，且人工Tau 寡聚體注射后在2 月齡時即可出現典型的Tau 聚集和小鼠功能認知障礙，故人工Tau寡聚體注射的造模方法常單用或者與轉基因方法以及其他非轉基因方法聯用，以研究AD 的病理機制以及各種類型的藥物作用篩選。

3 神經炎癥相關模型

3.1 側腦室和腦內注射鏈脲佐菌素

炎癥有助于機體的自身防御，但在腦神經細胞中長期的炎癥則會造成神經炎癥。在中樞神經系統中主要是小膠質細胞釋放大量炎癥因子促發慢性炎癥，造成神經組織的損傷，參加神經退行性疾病的發生。同時促炎因子也可以促進Aβ 斑塊的沉積和Tau磷酸化[7]。

側腦室注射鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ）誘導的腦狀態是一種廣泛使用的散發性阿爾茨海默病（sAD）模型。注射后3 個月觀察到背側海馬內神經元丟失，激活了神經炎癥，膽堿能傳遞不足，谷胱甘肽水平降低[8]。STZ處理的大鼠在21 d時空間學習和識別記憶、社會認知和視覺記憶中表現出顯著損傷。研究顯示實驗結果與STZ 劑量的應用和食物的攝入有關，故還需進一步研究加強明確造模方法[9]。在AD 患者分子病理中，以胰島素抵抗腦狀態和腦葡萄糖代謝改變為表現的中樞代謝功能障礙最近受到關注。胰島素抵抗腦狀態現被認為是一種常見的潛在代謝病理和神經退行性過程的貢獻者，而不是特定的神經退行性疾病的直接原因[10]。sAD 被認為與腦內胰島素受體信號受損有關。使用β 細胞毒性藥物STZ進行側腦室注射后，模型大鼠出現胰島素抵抗的大腦狀態[11]。故該模型也常用于胰島素信號與AD在大腦中聯系的研究。但該模型具有局限性，在造模過程中發現，雄性大鼠對于STZ 的敏感性高于雌性大鼠，這與AD 女性多與男性的發病相悖，目前尚不清楚哪些變化是由于性類固醇調節引起的[12]。

3.2 側腦室和腦內注射脂多糖

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）又叫內毒素，是革蘭陰性菌細胞壁的組成成分。慢性脂多糖處理誘導的系統性炎癥導致轉基因AD 小鼠模型腦內脂代謝異常，與cPLA2 活性的潛在變化有關。其表現為區分功能障礙，但對空間記憶沒有影響[13]。而長期LPS 刺激可導致記憶和學習障礙[14]。不同年齡的大鼠對于LPS 的敏感度即神經炎性反應也不同，其中最敏感的為老齡組大鼠（23 月齡），其表現為產生γ干擾素[15]。該方法通常與轉基因方法聯用，加重AD病理表現，縮短造模時間。

4 腺相關病毒模型

腦定位注射腺相關病毒。腺相關病毒是一種不依賴于包膜的細小DNA病毒。該模型病理檢測發現大鼠出現突觸損傷、Aβ 沉積以及神經炎等病理特征，顯著損害了空間記憶和長期記憶。在體外實驗中可以發現Aβ 能誘導星形膠質細胞中GluN2A 顯著增加[16]。該成果迅速運用到腺相關病毒模型的制作中，給小鼠腦內輸入含有星型膠質細胞特異性啟動子的GluN2AA-shRNA 腺相關病毒，結果顯示這一操作加重了小鼠的空間行為認知障礙。該造模方法簡單易操作且造模時間短，但無可避免的會對腦組織造成一定傷害。若通過靜脈注射，黏膜給藥等方法，由于血腦屏障的存在，會減少入腦病毒的濃度。該方法亦可用在轉基因AD 模型小鼠中，以加快造模進程。

5 衰老相關模型

制作方法為腹腔或皮下注射D-半乳糖，連續90 d，通過激活氧化應激反應，加重神經炎性反應，影響線粒體功能促進細胞凋亡等制備衰老AD 模型。90 d 后小鼠的學習記憶能力顯著下降，腦組織氧化還原酶等下降，腦細胞萎縮凋亡[17]。此法也可以同時注射亞硝酸鈉，使血紅蛋白變成高鐵血紅蛋白，失去攜氧能力，加重多器官缺血缺氧，加快造模進程。該方法常與其他轉基因或非轉基因辦法同時應用，誘發或加重AD 相關病理表現。此方法若單獨使用局限性較大，其造模時間長，且不具備典型的AD 病理特征，并且不同品種，不同年齡小鼠對D-半乳糖敏感程度不同，其造模時間與病理檢測時間相對不好制定。近些年有研究證明小劑量的D-半乳糖或可增強小鼠的空間記憶學習能力，且有研究表明短期的（小于8 周）的給藥未造成小鼠類似AD 的病理表現[18]，故據此得出結論D-半乳糖的給藥時間以及劑量的確定對于造模非常重要。

6 飲食及環境相關模型

無論是在模型的制作中還是在人AD 的發病誘因中，都不可忽視飲食和環境的因素。長期高糖、高脂、高鹽飲食會增加患AD 的風險。但在近期研究中給AD 患者使用降膽固醇他汀類藥物并不能有效延緩或是緩解AD 的發病進程，且高膽固醇飲食模型腦內Aβ 沉積以及腦萎縮現象均不明顯[19]。也有研究顯示，膽固醇調節基因變異會增加AD 的患病風險，故使用高膽固醇飼喂方法對于AD 的造模還有很大的爭議。郭琳等[20]給予小鼠吸入可吸入顆粒物PM10，實驗結果顯示，小鼠大腦皮層有助于記憶功能的NR2B 蛋白的表達與PM10的暴露濃度呈正相關，且大鼠海馬區神經元突觸減少，突觸前突觸小泡增多，突觸后致密物增厚也與PM10暴露濃度呈正相關，即可吸入顆粒造成神經功能損傷。劉穎等[21]給予小鼠吸入大氣顆粒物，并同時進行高質高糖飼喂，結果3 個月后實驗小鼠即出現空間記憶損傷，且隨時間損傷程度逐漸增加，該試驗方法有效的降低了實驗鼠的學習記憶能力。國外學者用2%~3.8%的甲醛溶液飼喂小鼠，10 d 后造成小鼠空間記憶受損，海馬體萎縮，Tau 蛋白磷酸化水平升高，但無Aβ 斑塊沉積[22]。還有學者研究了丙烯醛處理小鼠，導致小鼠在一月齡時即出現AD 的經典病變和嗅覺障礙，丙烯醛模型小鼠突觸損傷和神經炎癥的原因可能是激活海馬RhoA/ROCK2/p-cofilin 相關通路[23]。應用興奮性毒素如鵝膏蕈氨酸、奎司奎酸、紅藻氨酸等，也可一定程度上引發AD 樣病理表現。但由于產生Aβ 斑塊能力不穩定，Tau磷酸化程度參差不齊故對于病理特點的研究意義不大，常聯合其他造模方法同時使用，縮短造模時間。

7 岡田酸誘導模型

岡田酸（okadaic acid，OA）也叫軟海綿酸，是腹瀉型貝毒的一種。OA 有神經毒性，影響海馬神經遞質的活性，使Tau 蛋白過度磷酸化形成神經纖維纏結，從而導致嚴重的記憶障礙。通過腦內注射和鼻腔給藥兩種方法，常與缺氧方法聯用[24]。吳敏霞等[25]研究顯示，模型小鼠在Morris水迷宮和逃避與潛伏實驗中產生明顯的空間記憶障礙，且小鼠腦內產生明顯的神經纖維纏結和Tau過磷酸化現象。是制作研究AD病理特征，治療方法的良好模型。但此法也不可避免地損傷部分腦細胞，且對于OA 的最佳給藥時間和頻次相關研究較少，還需繼續研究探索。

8 金屬離子紊亂相關模型

AD 的組織病理學特征是細胞內的神經纖維纏結和細胞外由Aβ 與銅、鐵或鋅等金屬離子聚集形成的老年斑。當與Aβ 結合時，氧化還原活性金屬離子。如銅可以催化產生活性氧，尤其是反應活性最強的羥基自由基，可能對Aβ 肽本身及周圍分子造成氧化損傷[26]。有學者成功用三氯化鋁和硫酸銅處理大鼠成功制作了AD 動物模型，其產生嚴重的空間記憶能力損害，并失去物體辨別能力，產生中樞神經炎癥，膽堿能傳遞障礙等病理特征[27]。銻、鋅等金屬離子也可產生類似的效果[28]。這造模方法較為簡單，通過飼喂即可誘導模型產生。但單一的金屬離子誘導模型困難，最好聯合轉基因方法或其他非轉基因方法例如Aβ寡聚體注射等。

9 總結與展望

現存的AD 轉基因造模方法費用昂貴且造模時間長，但病理變化特征和人類AD 較為類似。而非轉基因方法大多利用AD 的誘發因素進行操作，雖然操作簡單造模成本低，但注射的方法都無法避免一定程度的腦損傷，且因注射位置固定導致病變范圍較為局限，與AD 的全身性的病理特征有較大區別。每一種造模方法都有自己的優缺點，并沒有一種模型能概括AD 的所有特征，選擇合適的模型來評估潛在的治療干預措施。最重要的是明確臨床治療的相關目標，確定治療相關的時間點，所以實驗者可以根據實驗所需選擇適合的模型進行造模。

非轉基因方法未來的發展是解決腦外傷的問題，尋找一類可以通過血腦屏障的藥物，或是對現存的藥物進行修飾使之能過通過靜脈注射，跨越血腦屏障發揮生物效應。現階段對于Tau 過磷酸化形成神經纖維纏結，以及中樞神經炎癥的研究處于高速發展階段，這也將是動物模型的發展方向。目前AD動物模型造模方法已經取得了一定的進展，但由于AD 發病機制以及神經生物學基礎、免疫基礎以及生活中各類影響因素的研究尚未完善，對于AD 動物模型的研究依舊處于發展階段，對于各種類型的AD 模型還需進一步研究和完善。