超聲分子影像組學評估前列腺癌前列腺特異膜抗原表達:實驗研究

李 蓉,黃釗希,黃方易,袁 晗,高 泳

(廣西醫科大學第一附屬醫院超聲科,廣西 南寧 530021)

前列腺癌(prostate cancer,PCa)居男性癌癥死因第2位[1],其前列腺特異膜抗原(prostate specific membrane antigen,PSMA)表達水平與疾病進展、復發顯著相關[2],PSMA表達水平越高,則患者生存期越短。靶向PSMA放射性藥物具有廣闊應用前景,但篩選最佳收益患者至關重要[3-4]。臨床主要通過PSMA-PET診斷PSMA陽性PCa[3],但因價格昂貴、有放射性、檢查時間長等而應用受限。影像組學對于評價腫瘤基因表達具有重要價值。既往研究[5-6]基于影像組學預測腫瘤Ki-67、KRAS等基因表達,或利用68鎵標記PSMA配體進行PET/MR成像[7]而發現PCa MRI紋理特征與其PSMA表達相關,但鮮見基于超聲分子成像構建超聲組學模型評估PCa PSMA表達相關研究。本研究建立不同PSMA表達人前列腺腫瘤細胞移植瘤裸鼠模型,觀察超聲分子影像組學評估其PSMA表達的價值。

1 材料與方法

1.1 制備與檢測靶向PSMA超聲納米泡(nanobubble,NB)

1.1.1 制備NB 按比例稱取1,2-二棕櫚酰-錫-甘油基-3-磷酸膽堿(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DPPC)、1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸(1,2-dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphate,DPPA)、1,2-二棕櫚酰基-sn-丙三基-3-磷酸乙氨醇(1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphorylethanolamin,DPPE)及二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[carboxy(polyethylene glycol)],DSPE-PEG-COOH),與氯仿混合并充分溶解,置于加熱板上制成薄膜小瓶。加入Pluronic 124和甘油,65℃水浴后混合均勻;注入全氟丙烷氣體后高速振蕩60 s,4℃倒置分層2 h,抽取下層清液,即NB。按比例加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-carbodiimide,EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)、PSMA多肽(序列為CQKHHNYLC,攜FITC熒光基團,由多個氨基酸合成),加入磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)離心清洗3次,以去除未結合的PSMA多肽,制得靶向PSMA超聲NB(PSMA-NB),置于4℃條件下避光保存。

1.1.2 檢測PSMA-NB表征 取適量上述樣品,以預冷PBS稀釋至1∶1 000倍;采用馬爾文納米粒度電位儀,參數設置為T=25℃、laser wavelengh=660 nm、angle=90°,檢測其平均粒徑及Zeta電位。

1.1.3 體外PSMA-NB超聲造影(contrast-enhanced ultrasound,CEUS) 取適量上述樣品,以預冷PBS稀釋至1∶100倍。采用GE Logiq E9超聲儀、9L-D探頭行體外CEUS,頻率7 MHz,機械指數0.11,動態范圍54 dB,增益3 dB,觀察PSMA-NB用于體外成像的效果。

1.2 動物實驗

1.2.1 實驗材料 19只4～5周齡BALB/C-nu雄性裸鼠由廣西醫科大學實驗動物中心提供;人前列腺癌22RV1細胞株、PC-3細胞株購自北京協和細胞資源中心。本研究通過廣西醫科大學動物倫理委員會批準(202203767)。

1.2.2 構建人前列腺腫瘤細胞移植瘤裸鼠模型 以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養人前列腺癌細胞系22RV1細胞(PSMA表達陽性),以含10%胎牛血清的F-12K培養基培養人前列腺癌細胞系PC-3細胞(PSMA表達陰性)[8]。取對數生長期細胞,按1×107個細胞/只將22RV1細胞接種于9只裸鼠背部右側皮下(陽性組),將PC-3細胞以5×106個細胞/只接種于10只裸鼠背部右側皮下(陰性組)。

1.2.3 靶向PSMA超聲分子成像 待移植瘤最大徑達約1.0 cm時以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉荷瘤裸鼠,以GE Logiq E9超聲儀、9L-D探頭,選取移植瘤最大切面,先行常規成像,再于經尾靜脈注射200 μl PSMA-NB后行CEUS,參數同前。

1.2.4 腫瘤組織學分析 造影結束后取出腫瘤組織并制備切片標本,采用Hoechst 33342熒光染料避光染色5 min,以抗熒光衰減劑封片;以正置熒光顯微鏡于200倍下觀察PSMA-NB與22RV1、PC-3腫瘤組織結合情況。

1.3 影像組學分析

1.3.1 分割圖像及提取特征 將超聲分子成像動態視頻分割為靜態圖片(每秒1幀),由2名具有10年以上工作經驗的超聲科醫師采用ITK-SNAP 3.8.0軟件共同勾畫腫瘤ROI(圖1),以Python軟件Pyradiomics包提取影像組學特征,包括形狀、一階特征、梯度特征、灰度共生矩陣(gray level co-occurrence matrix,GLCM)、灰度游程矩陣(gray level run length matrix,GLRLM)、灰度尺寸區域矩陣(gray level size zone matrix,GLSZM)、鄰域灰度差分矩陣(neighbourhood gray tone difference matrix,NGTDM)、灰度相關矩陣(gray-level dependence matrix,GLDM)及小波變化等。

圖1 勾畫人前列腺癌22RV1細胞裸鼠皮下移植瘤ROI示意圖 A.灰階聲像圖; B.CEUS圖; C.移植瘤ROI(紅色區域)

1.3.2 選擇特征與構建模型 將提取特征行加權平均及Z-score標準化處理。隨機選取64幅CEUS圖,計算其影像組學特征的組內相關系數(intra-class correlation coefficient,ICC),針對ICC>0.75者行獨立樣本t檢驗,保留差異有統計學意義(P<0.05)特征,以Pearson相關性分析進行降維,設閾值為0.9。

按7∶3比例將裸鼠隨機分為訓練集(n=13,包括陽性5只、陰性8只)與測試集(n=6,包括陽性4只、陰性2只)。采用最小絕對收縮和選擇算子(least absolute shrinkage and selection operator,LASSO)篩選關鍵特征,再通過多層感知機(multilayer perceptron,MLP)構建影像組學模型,以5折交叉驗證檢驗其穩定性。

1.4 統計學分析 采用Python 3.7統計分析軟件,繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線,計算曲線下面積(area under the curve,AUC),評價影像組學模型診斷PSMA陽性PCa的效能。

2 結果

2.1 PSMA-NB表征檢測 PSMA-NB平均粒徑為(392.2±31.56)nm,Zeta電位為(-29.3±0.95)mV,見圖2。

2.2 體外PSMA-NB CEUS PSMA-NB呈點狀均勻細膩強回聲,PBS顯示為無回聲的液性暗區。PSMA-NB用于體外成像效果理想。見圖3。

圖3 體外PSMA-NB CEUS圖 A.顯示PSMA-NB; B.顯示PBS

2.3 組織學分析 熒光顯微鏡下PSMA-NB呈綠色熒光(FITC熒光基團),22RV1、PC-3腫瘤組織細胞核呈藍色熒光(Hoechst 33342染色);大量PSMA-NB分布于PSMA表達陽性的22RV1細胞周圍(圖4A),而PSMA表達陰性PC-3細胞周圍未見明顯PSMA-NB綠色熒光分布(圖4B)。

圖4 荷瘤裸鼠腫瘤組織PSMA-NB分布熒光合成圖(×200) A.PSMA表達陽性; B.PSMA表達陰性

2.4 影像組學特征篩選及模型建立 共分割694幅聲像圖并提取1 561個超聲紋理特征,根據ICC>0.75初步選出1 173個紋理特征。基于訓練集,經過單因素分析、Pearson相關性分析及LASSO回歸特征降維,最終篩選出3個與PSMA陽性表達相關的影像組學特征,包括1個GLSZM特征exponential_glszm_ZoneVariance及2個GLDM特征,即wavelet_HHH_gldm_SmallDependenceLowGrayLevelEmphasis與logarithm_gldm_DependenceVariance;以之構建的超聲分子影像組學模型診斷訓練集、測試集PSMA表達陽性PCa的敏感度分別為60.00%、50.00%,特異度均為100%,準確率分別為84.60%、66.70%,AUC分別為0.950、0.875,見圖5。

圖5 超聲組學模型診斷PSMA陽性PCa的ROC曲線

3 討論

超聲分子成像通過將靶向配體(抗體、肽等)連接至超聲造影劑表面、使之選擇性地與靶位點受體結合并積累而實現靶位點特異性成像。納米級造影劑可穿越腫瘤血管內皮間隙而進入腫瘤實質組織。本研究所制備的PSMA-NB可特異性識別并較長時間聚集于PSMA表達陽性PCa細胞周圍,故支持PSMA靶點特異性成像。

分析超聲分子圖像時需要手動勾畫ROI,存在主觀依賴性[9]。影像組學可從醫學圖像中提取高通量特征并加以分析,以反映組織潛在的病理生理學特征,具有評價腫瘤基因表達潛力[10]。本研究基于靶向PSMA超聲分子成像提取其動態圖像紋理特征,最終篩選出3個與PSMA陽性表達相關的影像組學特征。其中的exponential_glszm_ZoneVariance是經圖像強度指數預處理后提取的特征,可識別腫瘤內不同區域之間的信號強度差異以反映其異質性[11],或可用于觀察腫瘤內成分差異[12],PSMA表達水平不同使腫瘤及其微環境變得更加復雜,不斷演化最終導致腫瘤呈現異質性;logarithm_gldm_DependenceVariance是經圖像強度值對數預處理后提取的特征,其值越高代表依賴性差異越大,圖像紋理越不均勻[13];wavelet_HHH_gldm_SmallDependenceLowGrayLevelEmphasis則反映圖像的灰度分布特征,參數值越高代表灰度不均勻度越高[14]、紋理越粗糙。既往研究[15]表明,PSMA高表達可增強腫瘤內皮細胞血管生成活性,使腫瘤血管生成增加,導致圖像紋理增粗、灰度更不均勻。基于超聲分子影像提取組學特征不僅能反映腫瘤內異質性,還可顯示微血管灌注特征,獲得更多腫瘤信息。本研究基于以上特征構建的超聲分子影像組學模型評估訓練集和測試集PCa PSMA表達的AUC分別為0.950、0.875,提示其具有較高效能。

綜上所述,基于靶向PSMA的超聲分子影像組學模型可用于評估PCa裸鼠PSMA表達。

利益沖突:全體作者聲明無利益沖突。

作者貢獻:李蓉研究設計和實施、撰寫和修改文章;黃釗希圖像分析、圖像處理;黃方易數據分析、統計分析;袁晗查閱文獻;高泳指導、審閱文章、經費支持。