CircRHOT1調(diào)節(jié)miR-187-3p/SOX4軸對乳腺癌細胞增殖、凋亡和免疫逃逸的影響

孫沛 姜振偉 劉倩

（1.武漢市普仁醫(yī)院檢驗科，武漢 430080；2.武漢市普仁醫(yī)院腫瘤科，武漢 430080）

乳腺癌是世界各地最常見的婦科惡性腫瘤，具有生長迅速、易轉(zhuǎn)移的特性，是導(dǎo)致女性癌癥死亡的主要原因之一，臨床以手術(shù)切除、化療、免疫治療等綜合治療為主，但乳腺癌細胞發(fā)生的免疫逃逸會限制其臨床療效，因此全面探索乳腺癌生長及免疫逃逸的機制對其臨床療效的提升尤為重要［1-3］。環(huán)狀RNA ras同源物基因家族成員T1（circular RNA ras homolog family member T1，CircRHOT1）作為一種具有致癌作用的環(huán)狀RNA，在膀胱癌、肝癌、乳腺癌等惡性腫瘤中高度表達，敲除CircRHOT1可顯著抑制膀胱癌增殖和遷移，并增強其對NK細胞敏感性，降低肝癌細胞的生長、遷移和侵襲能力，還可通過增強鐵死亡來抑制乳腺癌細胞增殖和體內(nèi)乳腺癌腫瘤生長，并誘導(dǎo)其大量凋亡［4-6］，從機制上講，CircRHOT1作為微小RNA（miRNA）的海綿來調(diào)控下游癌基因表達，進而介導(dǎo)人類癌癥發(fā)生和進展，通過查詢Starbase數(shù)據(jù)庫進行生物信息學(xué)分析可知，CircRHOT1可能通過海綿化miR-187-3p來調(diào)節(jié)性別決定區(qū)Y框蛋白4（sex-determining region Y-box 4，SOX4）的表達。研究顯示，miR-187-3p是一種具備抗癌功效的微小RNA分子，可介導(dǎo)癌細胞的增殖、凋亡、遷移和腫瘤免疫微環(huán)境進展，上調(diào)miR-187-3p可抑制人腎透明細胞癌細胞體內(nèi)外增殖和侵襲，并改善其腫瘤免疫浸潤微環(huán)境，還能顯著降低乳腺癌細胞增殖活性，增強其對吉西他濱的敏感性，并促進其細胞凋亡［7-8］；SOX4是調(diào)控嵌合抗原受體T細胞功能和惡性腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵因子，在人類原發(fā)性惡性腫瘤中高表達，并可增強乳腺癌在體內(nèi)外的生長和轉(zhuǎn)移［9］，下調(diào)SOX4可通過延緩嵌合抗原受體T細胞功能衰竭以提高實體瘤的免疫治療效果，還可顯著降低乳腺癌細胞的增殖和遷移能力，并促使其凋亡［10-11］，因而推測CircRHOT1可能通過調(diào)節(jié)miR-187-3p/SOX4軸影響乳腺癌細胞增殖、凋亡和免疫逃逸，本文通過敲低體外培養(yǎng)的乳腺癌細胞MCF-7中CircRHOT1和上調(diào)miR-187-3p來對此推測進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與試劑 人正常乳腺上皮細胞MCF-10A（貨號：CL-0525）、DMEM/F12培養(yǎng)基（貨號：PM150312）、人乳腺癌細胞MCF-7（貨號：CL-0149）、MEM培養(yǎng)基（貨號：PM150410）、人乳腺癌細胞Hs-578T（貨號：CL-0114）、DMEM高糖培養(yǎng)基（PM150210）、人乳腺癌細胞MDA-MB-231（貨號：CL-0150A）、Leibovitz's L-15培養(yǎng)基（貨號：PM151010）購自武漢普諾賽生命科技有限公司；脂質(zhì)體2000（貨號：11668-027）、特級胎牛血清（貨號：16000-044）購自美國Gibco公司；總RNA提取試劑Trizol（R1100）、MTT細胞增殖檢測試劑盒（貨號：M1020）、人外周血淋巴細胞分離液（貨號：P8610）、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（貨號：CA1020）、一步法實時熒光定量PCR試劑盒（T2210）購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗人Anti-SOX4抗體（貨號：abs132989）購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司；FITC標記的抗人CD8抗體（貨號：ab95591）、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗（貨號：ab205718）、小鼠抗人Anti-Bcl-2抗體（貨號：ab692）購自美國Abcam公司；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒（貨號：E608001）購自上海生工生物工程股份有限公司；EdU-488細胞增殖檢測試劑盒（貨號：C0071L）、×10結(jié)晶紫染色液（貨號：C0121）、兔抗人Anti-GAPDH抗體（貨號：AF1186）、免疫熒光染色試劑盒-抗小鼠Alexa Fluor 488（貨號：P0188）、兔抗人Anti-Bax抗體（貨號：AF0057）、免疫熒光染色試劑盒-抗兔Alexa Fluor 555（貨號：P0179）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 實驗儀器 實時熒光定量PCR儀（型號：MA-6000）購自濟南泰醫(yī)生物技術(shù)有限公司；定時雙穩(wěn)電泳儀電源、四板轉(zhuǎn)印電泳儀、一體式凝膠成像系統(tǒng)、四板垂直電泳儀（型號：DYY-3C、DYCZ-40S、WD-9413D、DYCZ-24KF）購自北京六一生物科技有限公司；酶標分析儀（型號：HBS-1096A）購自無錫集佳智能科技有限公司；研究級生物熒光顯微鏡、光學(xué)顯微鏡（型號：RX50、EX30）購自北京知微儀器有限公司；流式細胞儀（型號：CyFlow-Cube8）購自廣州吉源生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光PCR和免疫印跡實驗檢測MCF-10A、MCF-7、Hs-578T、MDA-MB-231細胞CircRHOT1、miR-187-3p與SOX4表達 取出凍存的MCF-10A、MCF-7、Hs-578T、MDA-MB-231細胞，快速放入40 ℃溫水浴中解凍復(fù)蘇，37.5 ℃下1 000 r/min 離心5 min后，分別加入均混有10%特級胎牛血清的DMEM/F12、MEM、DMEM高糖、Leibovitz's L-15培養(yǎng)基，混勻后放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當80%細胞融合后進行傳代培養(yǎng)，采用Trizol試劑分別提取傳代的各細胞總RNA，然后每種細胞取適量總RNA通過一步法進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，具體反應(yīng)條件依照一步法實時熒光定量PCR試劑盒說明書設(shè)定，CircRHOT1、SOX4用GAPDH做內(nèi)參對照，miR-187-3p用U6做內(nèi)參對照，各基因所得循環(huán)閾值采用2-ΔΔCt算法計算其相對表達，其引物序列見表1。

表1 各基因引物序列Tab.1 Primer sequence of each gene

取傳代的MCF-10A、MCF-7、Hs-578T、MDAMB-231細胞，采用RIPA裂解液分別提取其中總蛋白，通過BCA法測出其濃度后煮沸變性，每種細胞取出15 μg總蛋白通過電泳、濕轉(zhuǎn)實驗將其分離后轉(zhuǎn)膜，剪下SOX4、GAPDH蛋白后以5%脫脂奶粉溶液封閉、兔抗人Anti-SOX4、GAPDH一抗孵育、洗膜、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗孵育、洗膜、化學(xué)發(fā)光法顯色、攝片，運用Image J軟件定量各蛋白灰度值并分析量化其相對表達。

1.2.2 分組處理MCF-7細胞并采集標本 取傳代的MCF-7細胞以1×105個/孔接種于24孔板中培養(yǎng)24 h，隨機分為對照組、CircRHOT1敲低組、miR-187-3p mimics組、共轉(zhuǎn)染陰性對照組、CircRHOT1敲低+miR-187-3p inhibitor組，除對照組外的其余各組采用脂質(zhì)體2000并依照其說明指導(dǎo)分組進行轉(zhuǎn)染：CircRHOT1敲低組轉(zhuǎn)染CircRHOT1 siRNA質(zhì)粒，miR-187-3p mimics組轉(zhuǎn)染miR-187-3p mimics，共轉(zhuǎn)染陰性對照轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒和miR-187-3p inhibitor陰性對照，CircRHOT1敲低+miR-187-3p inhibitor組轉(zhuǎn)染CircRHOT1 siRNA質(zhì)粒和miR-187-3p inhibitor，各組細胞均轉(zhuǎn)染24 h后收集其細胞沉淀作為標本備用。

1.2.3 實時熒光PCR和免疫印跡實驗檢測各組MCF-7細胞CircRHOT1、miR-187-3p與SOX4表達取出1.2.2中收集的各組MCF-7細胞，分別提取出其總RNA和總蛋白后檢測各組CircRHOT1、miR-187-3p與SOX4表達，方法見1.2.1。

1.2.4 EdU染色和平板集落形成實驗檢測各組MCF-7細胞增殖 EdU染色實驗：取傳代的MCF-7細胞以1×105個/孔密度接種于24孔板中培養(yǎng)24 h，依照1.2.2中方法分組并進行細胞轉(zhuǎn)染，24 h后加入終濃度為10 μmol/L的EdU工作液孵育2 h，并進行DAPI染色，依照EdU-488細胞增殖檢測試劑盒說明指導(dǎo)在熒光顯微鏡下觀察各組細胞并拍照，計算EdU陽性率，EdU陽性率（%）=EdU陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

平板集落形成實驗：取傳代的MCF-7細胞以50個/孔密度接種于24孔板中培養(yǎng)24 h，依照1.2.2中方法分組并進行細胞轉(zhuǎn)染，24 h后棄去含轉(zhuǎn)染試劑的舊培養(yǎng)基，加入新的混有10%特級胎牛血清的MDM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3周，期間每2 d半換1次培養(yǎng)基，然后棄去培養(yǎng)基，對細胞做漂洗、固定、結(jié)晶紫染色、漂洗處理，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組細胞集落并拍照，計算集落生成率，集落生成率（%）=轉(zhuǎn)染組細胞集落數(shù)/對照組細胞集落數(shù)×100%。

1.2.5 流式細胞實驗檢測各組MCF-7細胞凋亡取傳代的MCF-7細胞以1×105個/孔細胞的密度接種在24孔板中培養(yǎng)24 h，依照1.2.2中方法分組并進行細胞轉(zhuǎn)染，24 h后胰酶消化并收集各組細胞沉淀，以PBS清洗后重懸，測出其細胞密度后每組取出約1×105個細胞，采用凋亡檢測試劑盒做Annexin VFITC/PI雙染，PBS清洗后重懸，采用流式細胞儀對各組細胞凋亡情況進行檢測。

1.2.6 免疫熒光染色檢測各組細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達比值（Bax/Bcl-2） 取傳代的MCF-7細胞以1×105個/孔的密度接種于24孔板中培養(yǎng)24 h，依照1.2.2中方法分組并進行細胞轉(zhuǎn)染，24 h后棄去培養(yǎng)基，對細胞做漂洗、固定、封閉處理，然后加入兔抗人Anti-Bax一抗和小鼠抗人Anti-Bcl-2一抗孵育、漂洗、加入免疫熒光染色試劑盒中Alexa Fluor 555偶聯(lián)抗兔二抗和Alexa Fluor 488偶聯(lián)抗小鼠二抗孵育、DAPI染色、漂洗，在熒光學(xué)顯微鏡下觀察各組細胞Bax（綠色熒光）和Bcl-2表達（紅色熒光），運用Image J軟件分別定量其平均熒光強度后計算Bax/Bcl-2，Bax/Bcl-2=綠色平均熒光強度/紅色平均熒光強度。

1.2.7 流式細胞實驗檢測與MCF-7細胞共培養(yǎng)的人外周血淋巴細胞中活化CD8+T細胞比例 采用人外周血淋巴細胞分離液提取本院健康志愿者（獲得其知情同意書）外周血中淋巴細胞，本研究通過武漢市普仁醫(yī)院倫理委員會審批［（k2022）年審第（002）號］。以混有10%特級胎牛血清的MEM培養(yǎng)基重懸，測出其細胞密度后以2∶1（人外周血淋巴細胞∶MCF-7細胞）的比例與MCF-7細胞共培養(yǎng)24 h，依照1.2.2中方法分組并進行細胞轉(zhuǎn)染，24 h后吸出各組培養(yǎng)基，收集其中懸浮生長的淋巴細胞，1 000 r/min、37.5 ℃ 離心5 min后，以PBS清洗后重懸，分別加入FITC標記的抗人CD8抗體避光孵育（每組取一部分細胞加入IgG抗體設(shè)空白對照），20 min后再次1 000 r/min、37.5 ℃ 離心 5 min，以PBS清洗、重懸后，采用流式細胞儀對各組淋巴細胞中活化CD8+T細胞比例進行檢測。

1.2.8 MTT法檢測人外周血淋巴細胞對MCF-7細胞殺傷率 取一個無菌96孔板接種人外周血淋巴細胞和MCF-7細胞建立共培養(yǎng)體系，方法見1.2.7，培養(yǎng)24 h后依照1.2.2中方法分組并進行細胞轉(zhuǎn)染，24 h后吸出各組培養(yǎng)基，棄去其中懸浮生長的淋巴細胞，剩余貼壁生長的MCF-7細胞加入含適量MTT工作液和10%特級胎牛血清的MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h，然后取出96孔板依照MTT細胞增殖檢測試劑盒說明指導(dǎo)檢測各組細胞吸光度，計算各組人外周血淋巴細胞對MCF-7細胞的殺傷率，殺傷率（%）=（1-轉(zhuǎn)染組吸光度/對照組吸光度）×100%。

1.2.9 雙熒光素酶報告實驗檢測MCF-7細胞CircRHOT1 對miR-187-3p、miR-187-3p對SOX4的靶向調(diào)控 取傳代的MCF-7細胞以1×105個/孔的密度接種于24孔板中培養(yǎng)24 h，隨機分為野生miR-187-3p+空載組、野生miR-187-3p+CircRHOT1 過表達組、突變miR-187-3p+空載組、突變miR-187-3p+CircRHOT1 過表達組、野生SOX4+miR-187-3p mimics陰性對照組、野生SOX4+CircRHOT1 過表達組、突變SOX4+miR-187-3p mimics陰性對照組、突變SOX4+CircRHOT1 過表達組，采用脂質(zhì)體2000并依照其說明指導(dǎo)做細胞轉(zhuǎn)染：野生miR-187-3p+空載組轉(zhuǎn)染野生型miR-187-3p和空載質(zhì)粒，野生miR-187-3p+CircRHOT1 過表達組轉(zhuǎn)染野生型miR-187-3p和CircRHOT1 過表達質(zhì)粒，突變miR-187-3p+空載組轉(zhuǎn)染突變型miR-187-3p和空載質(zhì)粒，突變miR-187-3p+CircRHOT1 過表達組轉(zhuǎn)染突變型miR-187-3p和CircRHOT1 過表達質(zhì)粒，野生SOX4+miR-187-3p mimics陰性對照組轉(zhuǎn)染野生型SOX4 3'-UTR報告質(zhì)粒和miR-187-3p mimics陰性對照，野生SOX4+CircRHOT1 過表達組轉(zhuǎn)染野生型SOX4 3'-UTR報告質(zhì)粒和miR-187-3p mimics，突變SOX4+miR-187-3p mimics陰性對照組轉(zhuǎn)染突變型SOX4 3'-UTR報告質(zhì)粒和miR-187-3p mimics陰性對照，突變SOX4+CircRHOT1 過表達組轉(zhuǎn)染突變型SOX4 3'-UTR報告質(zhì)粒和miR-187-3p mimics，各組均于轉(zhuǎn)染24 h后收集細胞沉淀，采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒并依照其說明指導(dǎo)測定各組雙熒光素酶相對活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)采用軟件SPSS26.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料均采用±s表達。以單因素方差分析對多組間差異進行比較，采用SNK-q檢驗進行組間兩兩差異比較，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌細胞中CircRHOT1、miR-187-3p與SOX4表達檢測結(jié)果 與人正常乳腺上皮細胞MCF-10A相比，人乳腺癌MCF-7、Hs-578T、MDA-MB-231細胞CircRHOT1、SOX4蛋白與mRNA表達明顯升高（P＜0.05），miR-187-3p表達明顯降低（P＜0.05）。見圖1、表2。

圖1 Western blot檢測人正常乳腺上皮細胞與乳腺癌細胞系SOX4表達Fig.1 Expression of SOX4 in human normal breast epithelial cells and breast cancer cell lines detected by Western blot

表2 各細胞circRHOT1、miR-187-3p與SOX4的相對表達水平（±s，n=6）Tab.2 Relative expression level of circRHOT1， miR-187-3p and SOX4 in each cell （±s， n=6）

表2 各細胞circRHOT1、miR-187-3p與SOX4的相對表達水平（±s，n=6）Tab.2 Relative expression level of circRHOT1， miR-187-3p and SOX4 in each cell （±s， n=6）

Note：Compared with MCF-10A cells， 1）P＜0.05.

SOX4 protein/GAPDH 0.33±0.04 0.82±0.091）0.69±0.141）0.74±0.081）Groups circRHOT1/GAPDH 1.03±0.16 2.26±0.221）1.90±0.111）2.04±0.201）miR-187-3p/U6 1.05±0.17 0.37±0.041）0.53±0.051）0.46±0.061）SOX4 mRNA/GAPDH 0.99±0.12 2.07±0.151）1.93±0.181）1.80±0.141）MCF-10A MCF-7 Hs-578T MDA-MB-231

2.2 各組MCF-7細胞CircRHOT1、miR-187-3p與SOX4表達檢測結(jié)果 與對照組相比，CircRHOT1敲低組細胞CircRHOT1、SOX4蛋白與mRNA表達降低（P＜0.05），miR-187-3p表達升高（P＜0.05）；miR-187-3p mimics組CircRHOT1表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），SOX4蛋白與mRNA表達降低（P＜0.05），miR-187-3p表達升高（P＜0.05）。與Circ-RHOT1敲低組相比，CircRHOT1敲低+miR-187-3p inhibitor組細胞CircRHOT1表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），SOX4蛋白與mRNA表達升高（P＜0.05），miR-187-3p表達降低（P＜0.05），共轉(zhuǎn)染陰性對照組細胞CircRHOT1、miR-187-3p、SOX4蛋白與mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、表3。

圖2 Western blot 檢測各組MCF-7細胞SOX4蛋白表達Fig.2 Detection of SOX4 protein expression in MCF-7 cells of each group by Western blot

表3 各組細胞CircRHOT1、miR-187-3p與SOX4的相對表達水平（±s，n=6）Tab.3 Relative expression levels of CircRHOT1， miR-187-3p and SOX4 in cells of each group （±s， n=6）

表3 各組細胞CircRHOT1、miR-187-3p與SOX4的相對表達水平（±s，n=6）Tab.3 Relative expression levels of CircRHOT1， miR-187-3p and SOX4 in cells of each group （±s， n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with CircRHOT1 knockdown group， 2）P＜0.05.

Groups CircRHOT1/GAPDH miR-187-3p/U6 SOX4 mRNA/GAPDH SOX4 protein/GAPDH Control CircRHOT1 knockdown miR-187-3p mimics Co-transfection negative control CircRHOT1 knockdown+miR-187-3p inhibitor 1.04±0.18 0.41±0.041）1.03±0.23 1.02±0.22 0.43±0.051）1.01±0.20 2.25±0.221）2.28±0.261）1.00±0.17 1.07±0.132）0.97±0.15 0.39±0.051）0.36±0.061）0.98±0.11 0.92±0.142）0.57±0.04 0.13±0.031）0.12±0.011）0.58±0.08 0.53±0.062）

2.3 各組MCF-7細胞增殖與凋亡檢測結(jié)果 與對照組相比，CircRHOT1敲低組、miR-187-3p mimics組細胞EdU陽性率與集落生成率降低（P＜0.05），凋亡率升高（P＜0.05）。與CircRHOT1敲低組相比，Circ-RHOT1敲低+miR-187-3p inhibitor組細胞EdU陽性率與集落生成率升高（P＜0.05），凋亡率降低（P＜0.05），共轉(zhuǎn)染陰性對照組細胞EdU陽性率、集落生成率、凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3～5、表4。

圖3 結(jié)晶紫染色檢測各組MCF-7細胞集落生成（×100）Fig.3 Detection of colony formation of MCF-7 cells in each group by crystal violet staining （×100）

圖4 EdU染色檢測各組MCF-7細胞增殖（×200）Fig.4 EdU staining to detect proliferation of MCF-7 cells in each group （×200）

圖5 流式細胞術(shù)檢測各組MCF-7細胞凋亡Fig.5 Detection of apoptosis of MCF-7 cells in each group by flow cytometry

表4 各組細胞EdU陽性率、集落生成率、凋亡率（±s，n=6，%）Tab.4 EdU positive rate， colony generation rate and apoptosis rate of cells in each group （±s， n=6，%）

表4 各組細胞EdU陽性率、集落生成率、凋亡率（±s，n=6，%）Tab.4 EdU positive rate， colony generation rate and apoptosis rate of cells in each group （±s， n=6，%）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05；compared with Circ-RHOT1 knockdown group， 2）P＜0.05.

Groups Control CircRHOT1 knockdown miR-187-3p mimics Co-transfection negative control CircRHOT1 knockdown+miR-187-3p inhibitor EdU positive rate 54.70±8.35 26.20±5.261）23.83±4.641）51.69±9.13 Colony generation rate 100.0±0.00 48.50±10.231）42.14±9.601）96.30±20.15 Apoptosis rate 3.20±0.91 54.91±10.201）49.65±11.141）2.97±0.93 48.78±8.382）90.10±18.302）6.01±1.952）

2.4 各組MCF-7細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達比值（Bax/Bcl-2）檢測 與對照組相比，CircRHOT1敲低組、miR-187-3p mimics組細胞Bax/Bcl-2升高（P＜0.05）。與CircRHOT1敲低組相比，CircRHOT1敲低+miR-187-3p inhibitor組細胞Bax/Bcl-2降低（P＜0.05），共轉(zhuǎn)染陰性對照組細胞Bax/Bcl-2差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖6、表5。

圖6 免疫熒光檢測各組MCF-7細胞Bax與Bcl-2表達（×1 000）Fig.6 Expressions of Bax and Bcl-2 in MCF-7 cells of each group detected by immunofluorescence （×1 000）

表5 各組細胞Bax/Bcl-2（±s，n=6）Tab.5 Bax/Bcl-2 of cells in each group （±s，n=6）

表5 各組細胞Bax/Bcl-2（±s，n=6）Tab.5 Bax/Bcl-2 of cells in each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05；compared with Circ-RHOT1 knockdown group， 2）P＜0.05.

Bax/Bcl-2 0.31±0.06 0.59±0.101）0.62±0.121）0.29±0.07 0.36±0.092）Groups Control CircRHOT1 knockdown miR-187-3p mimics Co-transfection negative control CircRHOT1 knockdown+miR-187-3p inhibitor

2.5 各組人外周血淋巴細胞中活化CD8+T細胞比例及其對MCF-7細胞的殺傷率檢測結(jié)果 與對照組相比，CircRHOT1敲低組、miR-187-3p mimics組人外周血淋巴細胞中活化CD8+T細胞比例及其對MCF-7細胞殺傷率升高（P＜0.05）。與CircRHOT1敲低組相比，CircRHOT1敲低+miR-187-3p inhibitor組人外周血淋巴細胞中活化CD8+T細胞比例及其對MCF-7細胞殺傷率降低（P＜0.05），共轉(zhuǎn)染陰性對照組人外周血淋巴細胞中活化CD8+T細胞比例及其對MCF-7細胞殺傷率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表6、圖7。

圖7 流式細胞術(shù)檢測人外周血淋巴細胞中活化CD8+T細胞比例Fig.7 Detection of proportion of activated CD8+T cells in human peripheral blood lymphocytes by flow cytometry

表6 各組人外周血淋巴細胞中活化CD8+T細胞比例及其對MCF-7細胞的殺傷率（±s，n=6，%）Tab.6 Proportion of activated CD8+T cells in human peripheral blood lymphocytes and their killing rate to MCF-7 cells in each group （±s， n=6，%）

表6 各組人外周血淋巴細胞中活化CD8+T細胞比例及其對MCF-7細胞的殺傷率（±s，n=6，%）Tab.6 Proportion of activated CD8+T cells in human peripheral blood lymphocytes and their killing rate to MCF-7 cells in each group （±s， n=6，%）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with Circ-RHOT1 knockdown group， 2）P＜0.05.

Groups Control CircRHOT1 knockdown miR-187-3p mimics Co-transfection negative control CircRHOT1 knockdown+miR-187-3p inhibitor Proportion of activated CD8+T cells 9.20±0.84 18.35±2.161）20.11±3.051）8.91±1.02 11.64±1.312）Killing rate 13.01±1.67 44.24±9.841）49.67±10.051）12.90±1.73 16.12±3.462）

2.6 MCF-7細胞內(nèi)CircRHOT1對miR-187-3p、miR-187-3p對SOX4的靶向調(diào)節(jié) 查詢Starbase數(shù)據(jù)庫可知CircRHOT1 與miR-187-3p之間存在結(jié)合位點，見圖8A。與野生miR-187-3p+空載組比較，野生miR-187-3p+CircRHOT1過表達組相對熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；突變miR-187-3p+空載組與突變miR-187-3p+CircRHOT1過表達組之間相對熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表7。

圖8 通過Starbase數(shù)據(jù)庫查詢得到的CircRHOT1 與miR-187-3p、miR-181-3p與SOX4之間結(jié)合位點Fig.8 Binding sites between CircRHOT1 and miR-187-3p，miR-181-3p and SOX4 obtained by querying Starbase database

表7 各組細胞相對熒光素酶活性（±s，n=6）Tab.7 Relative luciferase activity of cells in each group（±s， n=6）

表7 各組細胞相對熒光素酶活性（±s，n=6）Tab.7 Relative luciferase activity of cells in each group（±s， n=6）

Note：Compared with wild miR-187-3p+empty group， 1）P＜0.05.

Relative luciferase activity Groups 1.05±0.27 0.35±0.041）1.03±0.12 1.01±0.19 Wild miR-187-3p+empty Wild miR-187-3p+CircRHOT1 overexpression Mutant miR-187-3p+no-load Mutant miR-187-3p+CircRHOT1 overexpression

查詢Starbase數(shù)據(jù)庫可知miR-187-3p與SOX4之間有結(jié)合位點存在，見圖8B。與野生SOX4+miR-187-3p mimics陰性對照組比較，野生SOX4+miR-187-3p mimics組相對熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；突變SOX4+miR-187-3p mimics陰性對照組與突變SOX4+miR-187-3p mimics組之間相對熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表8。

表8 各組細胞相對熒光素酶活性值（±s，n=6）Tab.8 Relative luciferase activity of cells in each group（±s，n=6）

表8 各組細胞相對熒光素酶活性值（±s，n=6）Tab.8 Relative luciferase activity of cells in each group（±s，n=6）

Note：Compared with wild SOX4+miR-187-3p mimics negative control group， 1）P＜0.05.

Relative luciferase activity 1.04±0.28 0.32±0.031）1.02±0.27 0.98±0.25 Groups Wild SOX4+miR-187-3p mimics negative control Wild SOX4+miR-187-3p mimics Mutant SOX4+miR-187-3p mimics negative control Mutant SOX4+miR-187-3p mimics

3 討論

如今乳腺癌臨床治療理念已從“最大可耐受治療”向“最小的有效治療”轉(zhuǎn)變，保乳手術(shù)逐漸取代了全乳房切除術(shù)，很多研究證實保乳術(shù)后留下的乳房組織微環(huán)境在后續(xù)治療中發(fā)揮積極作用，通過增強乳房組織中乳腺癌所處微環(huán)境中免疫細胞活性，可誘發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)，促使全身乳腺癌細胞死亡，因此探尋有效抑制癌細胞增殖和免疫逃逸的手法對于改善乳腺癌患者預(yù)后具有積極意義［12-13］。CircRHOT1作為一種致癌基因，在乳腺癌中表達明顯升高，可促進乳腺癌體內(nèi)生長和惡性進展，對其進行敲除能夠抑制乳腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移，并誘導(dǎo)其凋亡，還可誘導(dǎo)細胞周期阻滯，顯著促進非小細胞肺癌和胰腺癌細胞凋亡，降低其增殖活性［6，14-15］。本研究結(jié)果顯示，人乳腺癌MCF-7、Hs-578T、MDA-MB-231細胞CircRHOT1表達相比人正常乳腺上皮細胞MCF-10A明顯升高，以CircRHOT1 siRNA質(zhì)粒敲低MCF-7細胞CircRHOT1表達，可降低CircRHOT1表達、EdU陽性率、集落生成率，提高細胞凋亡率、Bax/Bcl-2、人外周血淋巴細胞中活化CD8+T細胞比例及其對MCF-7細胞的殺傷率，表明敲低CircRHOT1可促進促凋亡蛋白表達，降低乳腺癌細胞增殖活力，抑制其免疫逃逸，促進人外周血淋巴細胞中CD8+T活化并增強其對MCF-7細胞殺傷力，對乳腺癌發(fā)揮明顯抗癌功效。

研究顯示，CircRHOT1介導(dǎo)癌癥發(fā)生發(fā)展的機制是通過海綿化miRNA來促進致癌基因表達，查詢Starbase數(shù)據(jù)庫可知，CircRHOT1可能通過結(jié)合miR-187-3p來調(diào)控SOX4表達，且miR-187-3p可在多種癌癥中發(fā)揮抗腫瘤作用，其過度表達能損害結(jié)直腸癌細胞集落形成、細胞遷移和侵襲功能，并誘導(dǎo)增強其化療敏感性，且與轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者無進展生存期和總生存期的增加有關(guān)，可顯著抑制乳腺癌細胞增殖并促進其凋亡［8，16-17］；SOX4作為一種致癌基因在乳腺癌中高表達，并顯著促進其腫瘤生長和惡性進展，敲除SOX4可抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并改善嵌合抗原受體T細胞功能，提升其對實體腫瘤的殺傷效果，因此推測敲除Circ-RHOT1抑制乳腺癌細胞增殖和免疫逃逸的分子機制可能是通過上調(diào)miR-187-3p來降低SOX4表達［10，18-19］。本研究結(jié)果顯示，人乳腺癌MCF-7、Hs-578T、MDA-MB-231細胞miR-187-3p表達相比人正常乳腺上皮細胞MCF-10A明顯降低，SOX4蛋白與mRNA表達明顯升高，以CircRHOT1 siRNA質(zhì)粒敲低MCF-7細胞CircRHOT1表達，可升高miR-187-3p表達，降低SOX4蛋白與mRNA表達，且雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示CircRHOT1可靶向下調(diào)miR-187-3p表達，miR-187-3p可靶向下調(diào)SOX4表達，說明CircRHOT1可通過調(diào)節(jié)miR-187-3p/SOX4軸介導(dǎo)乳腺癌細胞增殖、凋亡和免疫逃逸，且miR-187-3p/SOX4軸參與敲低CircRHOT1對乳腺癌細胞增殖和免疫逃逸的抑制過程。另外聯(lián)合轉(zhuǎn)染CircRHOT1 siRNA質(zhì)粒和miR-187-3p inhibitor，相比單獨轉(zhuǎn)染CircRHOT1 siRNA質(zhì)粒，可升高SOX4蛋白與mRNA表達、EdU陽性率、集落生成率，降低miR-187-3p表達、凋亡率、Bax/Bcl-2、人外周血淋巴細胞中活化CD8+T細胞比例及其對MCF-7細胞殺傷率，說明下調(diào)miR-187-3p可減弱敲低CircRHOT1對乳腺癌細胞的抗增殖和促凋亡作用，拮抗其對免疫逃逸的抑制，最終消除其對乳腺癌的抗腫瘤功效，提示敲低CircRHOT1抑制乳腺癌細胞增殖、免疫逃逸，并促使其凋亡是通過上調(diào)miR-187-3p實現(xiàn)的。

綜上所述，本研究證實了CircRHOT1可通過調(diào)節(jié)miR-187-3p/SOX4軸介導(dǎo)乳腺癌細胞增殖、凋亡和免疫逃逸過程，敲低CircRHOT1可通過上調(diào)miR-187-3p而降低SOX4表達，從而明顯抑制乳腺癌細胞增殖，促進其凋亡，促使CD8+T細胞活化并增強其殺傷力，減輕乳腺癌免疫逃逸，最終起到顯著抗癌作用，本研究揭示了調(diào)控乳腺癌生長和免疫逃逸的新分子機制，有助于開發(fā)改進其臨床免疫和分子靶向治療方法。