IL-10通過上調(diào)socs3抑制衣原體感染細胞炎癥因子表達

羅玲艷 杜昆 （長江大學(xué)附屬第一醫(yī)院輸血科，荊州 434000）

衣原體是一種全球普遍流行的性傳播疾病的病原體，常常感染生殖道、肛門直腸和口咽部的黏膜上皮細胞。女性生殖道感染衣原體后，易引起輸卵管性不孕及宮頸炎等并發(fā)癥［1-3］。有研究表明，衣原體感染后能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生大量炎癥因子，如IL-6、IL-8、IL-12及TNF-α等，過度產(chǎn)生的炎癥因子會對機體組織造成損傷［4-5］。因此，有效抑制炎癥因子的產(chǎn)生可降低對機體組織的損傷。IL-10具有很強的免疫抑制能力，能防止過度炎癥對機體組織造成的損傷［6］。IL-10與其受體結(jié)合后，通過激活JAK/STAT信號通路發(fā)揮作用。STAT3能誘導(dǎo)細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3（suppressors of cytokine signaling 3，SOCS3)蛋白產(chǎn)生，而SOCS3具有很強的抑制炎癥因子產(chǎn)生的能力。因此，推測IL-10可能通過誘導(dǎo)SOCS3蛋白抑制衣原體感染細胞炎癥因子的產(chǎn)生。本研究旨在探討IL-10抑制衣原體感染細胞炎癥因子的產(chǎn)生是否與SOCS3蛋白有關(guān)及其可能的機制，為衣原體感染防治工作提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 沙眼衣原體L2血清型和HeLa細胞均由中南大學(xué)余平教授惠贈；DMEM培養(yǎng)基購自Invitrogen；RT-PCR試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；ELISA試劑盒購自武漢博士德生物公司；人IL-10購自RD公司；所有抗體及socs3siRNA均購自Santa Cruz公司；Stattic購自Merck公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與沙眼衣原體增殖 將HeLa細胞解凍后接種到50 cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，DMEM培養(yǎng)基作為細胞培養(yǎng)液（含10%小牛血清）。細胞置于37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長成單層后用胰蛋白酶消化細胞并傳代培養(yǎng)。將沙眼衣原體L2懸液加入長有細胞的培養(yǎng)瓶中，2 h后棄上清，加入含有2 mg/L放線菌酮的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，感染48 h并收集細胞，反復(fù)凍融3次，3 000 r/min，10 min離心，吸取上清并于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RT-PCR 提取培養(yǎng)細胞總RNA，然后按照試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。PCR擴增基因，socs3基因正向引物5'-ATGGTCACCCACAGCAAGTT-3'，反向引物5'-CTTAAAGCGGGGCATCGTACTG-3'；β-actin基因正向引物5'-AGGCTGTGCTGTCCCTCT-3'，反向引物5'-TCCGGTGAGGAGGATGCG-3'。擴增條件：95 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火10 s，40個循環(huán)；最后72 ℃延伸30 s。

1.2.3 ELISA檢測細胞因子 按試劑盒說明書進行。加100 μl標準品和已用樣品稀釋液稀釋的待測樣本到反應(yīng)孔中，37 ℃反應(yīng)90 min；吸棄液體，每孔加入100 μl相應(yīng)抗體工作液，37 ℃反應(yīng)60 min；洗滌3次，每孔加入100 μl ABC工作液，37 ℃反應(yīng)30 min；洗滌5次，每孔加入90 μl TMB顯色液，37 ℃避光反應(yīng)15 min；每孔加入100 μl終止液，在450 nm處測定OD值。

1.2.4 Western blot 實驗 提取細胞總蛋白，取80 μg蛋白加入2×SDS緩沖液中，100 ℃沸水中加熱5 min，冷卻后上樣電泳；4 ℃、80 V轉(zhuǎn)膜 2 h，5%脫脂奶粉封閉1 h；加入一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次；加入HRP 標記二抗，孵育1 h，洗膜3次。最后用ECL發(fā)光試劑盒檢測蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS26.0軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，計量資料用±s表示，采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-10上調(diào)沙眼衣原體感染細胞socs3基因表達 檢測外源性IL-10對STAT3的活化情況，結(jié)果如圖1A所示，沙眼衣原體對STAT3活化不明顯，但IL-10（10 ng/ml）能使磷酸化的STAT3蛋白增多。進一步研究在IL-10作用下socs3基因表達情況，結(jié)果如圖1B所示，衣原體感染和未感染細胞，在IL-10（10 ng/ml）的作用下，socs3mRNA表達明顯增強；但在抑制劑Stattic作用下，socs3mRNA表達明顯降低。加抑制劑組和未加抑制組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 沙眼衣原體通過活化STAT3蛋白上調(diào)socs3基因表達Fig.1 Chlamydia trachomatis up-regulates socs3 expression by activating STAT3 protein

2.2 沙眼衣原體感染誘導(dǎo)IL-6、IL-12表達 用不同滴度的衣原體感染細胞，在感染后不同時間點檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-6和IL-12產(chǎn)生情況。結(jié)果如圖2A、B所示，沙眼衣原體能誘導(dǎo)感染細胞產(chǎn)生IL-6和IL-12，且隨著感染時間的延長，產(chǎn)生的量越多；同時在感染相同的時間點，感染滴度越大，產(chǎn)生的量也越多。感染后12 h，不同滴度的衣原體誘導(dǎo)的IL-6和IL-12比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；相同滴度的衣原體在感染不同時間誘導(dǎo)IL-6和IL-12比較差異也均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 沙眼衣原體感染誘導(dǎo)IL-6和IL-12表達Fig.2 Chlamydia trachomatis induces IL-6 and IL-12 expression in infected cells

2.3 IL-10通過誘導(dǎo)socs3抑制沙眼衣原體感染細胞IL-6、IL-12表達 用不同濃度的IL-10作用于衣原體感染細胞后檢測IL-6和IL-12表達情況，結(jié)果如圖3A所示，IL-10能明顯抑制IL-6和IL-12產(chǎn)生，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。由于IL-10能誘導(dǎo)socs3表達，而SOCS3蛋白具有抑制細胞因子產(chǎn)生的能力。采用RNA干擾抑制socs3表達，結(jié)果如圖3B所示，抑制socs3表達后，IL-10對IL-6和IL-12的抑制作用明顯減弱，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 IL-10通過誘導(dǎo)socs3抑制沙眼衣原體感染細胞IL-6和IL-12表達Fig.3 IL-10 inhibits expressions of IL-6 and IL-12 in Chlamydia infected cells by inducing socs3

2.4 SOCS3蛋白抑制p38和ERK活化 利用RNA干擾抑制socs3基因轉(zhuǎn)錄，然后檢測p38和ERK1/2活化情況。結(jié)果如圖4所示，沙眼衣原體感染能活化細胞p38和ERK1/2信號通路，而IL-10（10 ng/ml）能抑制該信號通路；但當socs3基因轉(zhuǎn)錄被抑制時，IL-10抑制感染細胞p38和ERK1/2信號通路的作用明顯減弱。表明IL-10能通過SOCS3蛋白抑制p38和ERK1/2通路活化。

圖4 SOCS3蛋白抑制p38和ERK活化Fig.4 SOCS3 protein inhibits p38 and ERK activation

3 討論

病原微生物入侵機體后，機體免疫系統(tǒng)會通過多種不同方式清除入侵的病原體。其中，炎癥因子的產(chǎn)生是清除入侵病原體的重要因素之一［7］。然而，炎癥因子產(chǎn)生過多，導(dǎo)致機體炎癥過強，雖然有利于病原體的清除，但同時也會對機體組織造成不可逆性的損害［8-9］。衣原體具有二相性生活周期，其整個生活周期都必須依賴宿主細胞。女性生殖道感染沙眼衣原體后，會發(fā)生盆腔炎、宮頸炎等并發(fā)癥，嚴重時甚至?xí)l(fā)生輸卵管性不孕［10-11］。因此，有效抑制衣原體感染后機體過強的炎癥反應(yīng)，能減少并發(fā)癥的發(fā)生。

IL-10能抑制衣原體感染細胞炎癥因子的產(chǎn)生，然而對其機制的報道較少［12-13］。IL-10與其受體結(jié)合后，主要通過JAK/STAT信號通路產(chǎn)生作用。為研究IL-10抑制衣原體感染細胞炎癥因子產(chǎn)生的機制，課題組首先檢測了IL-10對STAT的活化情況。結(jié)果表明，沙眼衣原體對STAT3活化并不明顯，但IL-10能使磷酸化的STAT3蛋白增多，證實IL-10能有效激活STAT3蛋白。STAT3蛋白活化后進入細胞核內(nèi)并調(diào)節(jié)許多基因的表達，其中socs基因是其重要的調(diào)節(jié)基因之一。為證實IL-10活化STAT3后是否調(diào)節(jié)socs3基因表達，本研究利用Stattic抑制STAT3活性，檢測在STAT3活性被抑制后，socs3基因表達是否發(fā)生變化。結(jié)果顯示，未加抑制劑時，在IL-10的作用下，衣原體感染和未感染細胞socs3基因表達明顯上調(diào)；但當加入抑制劑時，感染和未感染細胞socs3基因表達明顯降低；表明IL-10能通過STAT3蛋白誘導(dǎo)socs3基因表達。沙眼衣原體感染后能誘導(dǎo)感染細胞產(chǎn)生炎癥因子，課題組也進一步研究了本實驗中炎癥因子產(chǎn)生情況，用不同滴度的衣原體感染細胞，在感染后不同時間點檢測細胞培養(yǎng)上清IL-6和IL-12產(chǎn)生情況。結(jié)果顯示沙眼衣原體能誘導(dǎo)感染細胞產(chǎn)生IL-6和IL-12，且呈時間和劑量依賴性，與以往的報道相同［5，14］。由于IL-10有很強的抑制炎癥因子產(chǎn)生的能力，課題組繼續(xù)研究了IL-10是否能夠抑制衣原體感染細胞IL-6和IL-12的產(chǎn)生。課題組用3個不同濃度的IL-10作用于沙眼衣原體感染細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度的IL-10均能抑制IL-6和IL-12的產(chǎn)生，且隨著IL-10濃度的增加，抑制作用越明顯。課題組前期的研究顯示IL-10能誘導(dǎo)socs3基因表達，而SOCS3蛋白具有抑制細胞因子產(chǎn)生的能力［15］。為證實IL-10抑制IL-6和IL-12產(chǎn)生的能力是否與SOCS3蛋白有關(guān)，本研究通過RNA干擾抑制socs3基因表達，然后檢測socs3基因表達被抑制后，IL-10是否還能抑制IL-6和IL-12的產(chǎn)生。結(jié)果顯示，socs3基因表達被抑制后，IL-10的抑制作用明顯減弱。以上結(jié)果表明，IL-10有可能通過誘導(dǎo)SOCS3蛋白表達從而抑制衣原體感染細胞IL-6和IL-12產(chǎn)生。衣原體感染細胞后主要通過激活不同信號通路而誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生，如p38、ERK1/2等信號通路［16-17］。為研究IL-10是否可能通過誘導(dǎo)SOCS3蛋白影響細胞信號通路，從而影響炎癥因子的表達。本研究通過RNA干擾抑制SOCS3蛋白表達，然后檢測p38和ERK1/2活化情況。結(jié)果顯示衣原體感染后，宿主細胞p38和ERK1/2信號通路被活化；當感染細胞預(yù)先加入IL-10時，該信號通路明顯被抑制；但當socs3基因表達被抑制時，IL-10抑制感染細胞p38和ERK1/2信號通路的作用明顯減弱。表明IL-10可能通過SOCS3蛋白抑制p38和ERK1/2通路活性。

總之，IL-10能活化STAT3蛋白并誘導(dǎo)SOCS3蛋白表達，進一步抑制p38和ERK1/2通路活化，從而抑制炎癥因子的產(chǎn)生。這可能是IL-10抑制沙眼衣原體感染細胞炎癥因子產(chǎn)生的機制之一。