TLR4/ERK1/2信號通路在不明原因自然流產蛻膜組織中的作用研究

李娜 欒兆進△ 楊美霞 宮曉玲 趙紫薇 宋芳

（1.包頭醫學院組織學與胚胎學教研室，包頭 014000； 2.包鋼第三職工醫院，包頭 014000）

自然流產（spontaneous abortion，SA）是指妊娠不足28周，胎兒體質量不足1 000 g而終止者，其病因十分繁雜，在臨床上仍有近半數的患者病因不明。越來越多的研究認為SA與蛻膜免疫微環境異常有關［1］，在正常妊娠期間占主導地位的細胞型是Th2型細胞，具有維持母體和胎兒免疫耐受的作用；一旦Th1型細胞占主導地位，將導致流產發生［2］。Toll受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是蛻膜局部微環境重要的刺激信號之一，可經過轉導途徑引起母胎界面的免疫活性因子Th1/Th2失衡［3］。細胞外信號調節蛋白激酶（extracellular signal regulated protein kinase 1/2，ERK1/2）可誘導Th1型細胞分化，在母胎免疫調節和炎癥反應中發揮著關鍵調節作用［4］。LUO等［5］研究發現TLR4是ERK1/2的激活劑，病毒感染機體后，隨著TLR4的激活免疫反應啟動，MAPKs信號通路被激活，進一步磷酸化轉錄因子和細胞蛋白，最終加重了炎癥反應。然而，TLR4是否通過激活ERK1/2引發SA，是亟待解決的問題。因此，本文擬通過研究TLR4和ERK1/2在不明原因SA和正常妊娠蛻膜組織的表達差異及二者的相關性，探討蛻膜組織中TLR4通過ERK1/2信號途徑參與SA發生的可能性，為不明原因SA防治提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 流產組：2019年5月至2020年5月在包鋼第三職工醫院婦產科門診就診，夫妻雙方身體健康而B超提示胚胎死亡，需進行手術的32例不明原因SA患者。年齡22～31歲，平均（23.31±3.76）歲，妊娠時間（51±5） d。納入標準：①無明確致流產的因素；②初次發生自然流產。排除標準：有遺傳性疾病、不良飲食史、服藥史的患者。對照組：同期健康孕婦32例，年齡21～32歲，平均（24.32±3.38）歲，妊娠時間（53±5） d。無腹痛、陰道流血等癥狀，自愿行人工流產術。以上兩組所有研究對象均簽署知情同意書且本研究獲包頭醫學院醫學倫理委員會審批［包醫審2022第（1號）］。

1.1.2 主要試劑 小鼠抗人TLR4單克隆抗體（sc-293072，Santa Cruz公司）；兔抗人ERK1/2（4696S）、兔抗人p-ERK1/2單克隆抗體（4370S，Cell Signaling Technology公司）；免疫組化通用型試劑盒（PV-6000，中杉金橋公司）、辣根過氧化物酶二抗（A0208、A0216，碧云天公司）。

1.2 方法

1.2.1 標本收集與處理 將兩組患者手術后的蛻膜組織，快速用0.9%NaCl溶液清洗至無血色后，分為兩部分進行收集，一部分蛻膜組織用于免疫組織化學染色而進行包埋制成切片；另一部分蛻膜組織保存于-80 ℃冰箱，用于后續的Western blot檢測。

1.2.2 免疫組織化學染色（IHC）法 石蠟切片常規脫蠟水化；滴加鼠抗人TLR4（1∶200）、兔抗人ERK1/2（1∶250）和p-ERK1/2（1∶400）一抗，4 ℃冰箱內孵育12 h；滴加二抗進行孵育；顯色及細胞核復染后，常規操作直至封片完成，用SMART生物顯微鏡（B301）進行光鏡鏡檢。視野下每個標本留取5個不重復的清晰圖片（×200），用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算TLR4、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達相對含量，對兩組蛻膜組織進行半定量分析。

1.2.3 Western blot檢測 取流產組和對照組的每例蛻膜組織20 g收集到EP管中，通過BCA試劑盒檢測其蛋白濃度；電泳轉膜后將PVDF膜進行封閉；洗滌液洗膜后，滴加鼠抗人TLR4（1∶1 000）、兔抗人ERK1/2（1∶1 000）和兔抗人p-ERK1/2（1∶2 000）一抗，4 ℃冰箱孵育；二抗孵育后，洗膜后將膜放入顯影液中，避光3 min，將膜放入一體式凝膠成像系統（OI100 Touch），觀察條帶，根據內參條帶灰度值調整上樣量。使用Image J軟件進行灰度定量分析。

1.3 統計學處理 采用SPSS20.0統計軟件進行獨立樣本t檢驗；相關性用Pearson等級相關性分析。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學染色 在不明原因SA組和正常妊娠對照組蛻膜細胞的細胞質上都有TLR4、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表達，呈棕黃色顆粒，且各組陽性反應強弱有別（圖1）。

圖1 TLR4、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白在蛻膜組織中的表達（×200）Fig.1 Expressions of TLR4， ERK1/2 and p-ERK1/2 proteins in decidual tissue （×200）

圖像分析結果顯示，TLR4、p-ERK1/2蛋白在不明原因SA患者蛻膜組織的表達明顯高于正常妊娠對照者（P＜0.01）；與正常妊娠對照組相比，不明原因SA組蛻膜組織上ERK1/2的表達差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 TLR4、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白在蛻膜組織中的表達差異（±s）Tab.1 Different expressions of TLR4， ERK1/2 and PERk1/2 proteins in decidua tissues （±s）

表1 TLR4、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白在蛻膜組織中的表達差異（±s）Tab.1 Different expressions of TLR4， ERK1/2 and PERk1/2 proteins in decidua tissues （±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.01.

p-ERK1/2 0.436±0.0761）0.323±0.080 Control 0.102±0.0660.331±0.074 Groups SA TLR4 0.174±0.0301）ERK1/2 0.340±0.149

2.2 Western blot 結果顯示，在不明原因SA組蛻膜組織中，TLR4的蛋白相對含量高于正常妊娠對照組（P＜0.05），p-ERK1/2的蛋白相對含量明顯高于正常妊娠對照組（P＜0.01），ERK1/2的蛋白相對含量與正常妊娠對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05，圖2）。

圖2 Western blot分析TLR4、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白在蛻膜組織中的表達差異（±s）Fig.2 Western blot analysis of TLR4， ERK1/2， p-ERK1/2 protein expressions in decidua tissues （±s）

2.3 TLR4與p-ERK1/2的相關性分析 在不明原因SA組的蛻膜組織中，TLR4與p-ERK1/2的表達呈顯著正相關（r=0.890，P＜0.01，圖3）。

圖3 SA組TLR4與p-ERK1/2的相關性分析Fig.3 Correlation analysis of TLR4 and p-ERK1/2 in SA group

3 討論

SA病因與發病機制極其復雜，目前已經證明母體內分泌紊亂、感染性因素等都會引起SA的發生，但仍有約40%～50%的患者病因不明。在妊娠障礙相關疾病中，不明原因SA的發病率逐年增高，引起眾多學者的關注。目前，有研究表明不明原因SA的發生與蛻膜微環境免疫失衡有關。正常妊娠期間的關鍵細胞型是Th2型細胞，以分泌IL-4和TGF-β等細胞因子為主，這些Th2型細胞因子起到阻抑免疫炎癥反應作用，促進胎兒生長維持妊娠；Th1型細胞主要分泌的細胞因子有IL-2、IL-12和IFN-γ等，這些Th1型細胞因子在滋養細胞侵襲時具有一定的抑制作用，從而導致流產的發生。在胚泡植入的過程中，子宮內膜蛻膜化后成為蛻膜，蛻膜的免疫細胞群可以調控免疫平衡，發揮免疫抑制作用，同時能抵抗氧化應激、炎癥反應和免疫排斥等，維持母體對胎兒的耐受［6-7］。DU等［8］的研究表明蛻膜異常發育將引發SA，與金麗穎［9］的研究所得結論一致，在SA患者的蛻膜免疫微環境中，具有促血管生成能力的蛻膜自然殺傷（decidual natural killer，dNK）細胞數量有所降低，同時dNK細胞分泌IL-10和TGF-β減少，使滋養細胞入侵能力減弱，影響子宮螺旋動脈重塑，進一步影響胎盤形成，從而導致妊娠失敗。

TLR4與各種妊娠障礙有關，因為TLR4在妊娠維持尤其是免疫耐受中發揮重要調節作用，可激活其下游信號轉導通路NF-κB、MyD88、ERK等，引發Th1型細胞因子的分泌和免疫應答的發生［10］。從本實驗研究結果中可見：在不明原因SA患者蛻膜細胞的細胞質內TLR4蛋白有所表達，說明TLR4可能參與不明原因SA；Western blot結果顯示，TLR4蛋白表達量在不明原因SA患者蛻膜組織中高于正常對照組，該結果與XU等［11］的研究結果趨于一致。以往的動物實驗中發現，Th1型細胞激活會激活NK細胞，引起胎兒SA的級聯反應［12］，因此推測，TLR4蛋白表達上調促進Th1型細胞分泌更多的Th1型細胞因子，Th1型細胞因子參與免疫應答時抑制dNK細胞的表達，從而引起胚胎血管生成能力降低，子宮螺旋動脈重塑受阻，導致胚胎缺血、缺氧，阻礙胚胎發育，發生流產。

ERK1/2是經典的MAPK家族成員之一，ERK1/2活化能誘導Th1型細胞分化，促進細胞因子IL-2、IL-6、IL-8和TNF-α等的產生，調控Th1/Th2的平衡，在蛻膜免疫調節中發揮著關鍵作用。TLR4作為上游信號分子可以調控下游級聯反應，包括MAPKs的激活，刺激信號可激活磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2），將信息轉至細胞核內［13］。有研究表明，p-ERK1/2可以防止滋養細胞過度增殖，為胚胎的著床和生長發育提供所需的物質基礎［14］，但是關于ERK1/2在不明原因SA蛻膜組織中的作用未見報道，而且關于TLR4介導ERK1/2信號通路的研究主要集中在病毒感染免疫方面。本研究發現蛻膜細胞的細胞質是p-ERK1/2蛋白的表達定位點，且p-ERK1/2蛋白在不明原因SA組呈高表達，在對照組呈低表達；同時Western blot實驗結果與上述半定量結果趨于一致，p-ERK1/2蛋白水平在流產組明顯高于對照組，而ERK1/2蛋白的表達水平，在兩組中差異無統計學意義。以上結果提示，ERK1/2信號被激活后，其活化形式p-ERK1/2可能參與不明原因SA的發生。另外，在不明原因SA患者蛻膜組織中，TLR4與p-ERK1/2具有正相關性，推測TLR4/ERK1/2信號通路參與SA的發生，但不明原因SA蛻膜組織中TLR4/ERK1/2信號通路的改變是不明原因SA發生的原因還是結果尚不清楚。

研究發現，下調TLR4、ERK1/2基因及蛋白表達，可抑制炎癥反應［15］。由此推測，在不明原因SA蛻膜組織中，Th1型細胞因子的釋放可能是通過TLR4/ERK1/2信號途徑促進的，導致胚胎發育原本的蛻膜微環境被Th1型細胞因子的分泌而破壞，從而引發不明原因SA。在胚泡著床后，胚胎和蛻膜組織都有大量生長因子及其受體的轉錄，其中核轉錄因子激活蛋白1（activator protein-1，AP-1），在人胎盤中表達較廣泛，且AP-1活化后對胎盤形成及胎兒發育具有調控作用。VIEDT等［16］研究發現Th1型細胞因子的釋放過程需要AP-1參與調控，另外，OLDENHOF等［17］發現MAPK信號通路的激活可調節AP-1活性影響其活化。因此，可能是TLR4/ERK1/2/AP-1信號通路被激活后，增加Th1型細胞因子的分泌量，引起蛻膜微環境免疫失衡，導致SA的發生。

綜上所述，不明原因SA的發生過程可能涉及TLR4和ERK1/2參與，而且ERK1/2的活化可能是通過TLR4激活引起，但是關于TLR4/ERK1/2下游有哪些信號因子，共同參與不明原因SA的發生發展，有待于進一步研究。因此進一步研究蛻膜細胞中TLR4/ERK1/2通路發揮作用的機制將為闡明不明原因SA的分子機制提供幫助，對蛻膜細胞信號轉導的研究也可能為不明原因SA的治療提供新的思路。