干細胞治療椎間盤退變的研究進展

張蒯祥,楊江佳,殷建林,郝洋,章菲凡,李記天,,*

[1.河南省洛陽正骨醫院(河南省骨科醫院),河南 鄭州 450016;2.湖南中醫藥大學,湖南 長沙 410000;3.河南中醫藥大學,河南 鄭州 450046]

椎間盤退變(intervertebral disc degeneration,IDD)是臨床常見的椎間盤病理改變,IDD的發生給社會勞動力帶來了沉重負擔,同時也對患者家庭經濟造成一定的影響[1]。椎間盤由髓核(nucleus pulposus,NP)、纖維環和軟骨終板構成,是脊柱運動和負荷的結構支撐,其主要特點為：無血管、缺氧、低糖、低PH、高滲和機械負荷。IDD的原因復雜多樣,主要包括衰老、機械壓力、遺傳因素、缺乏鍛煉、吸煙、肥胖、感染、創傷等。IDD主要表現為椎間盤高度的降低、纖維環出現裂隙或斷裂、NP中膠原蛋白和水分的丟失、椎體終板的鈣化等結構的改變,繼而出現椎間盤膨出、突出、脫出等病理變化,并在相應部位出現疼痛、麻木等臨床表現。研究表明,退化的椎間盤可以產生大量炎癥因子,炎癥因子的產生同時又可以進一步加劇IDD的進程[2-3]。因此,在某種程度上,IDD治療可能存在一些困難。目前,IDD的治療方法主要包括保守治療和手術治療兩種。在保守治療中,主要是通過相應的物理療法(牽引、理療、推拿等)、藥物治療(中藥熏蒸、非甾體消炎藥、肌肉松弛藥物、改善微循環的藥物等)及康復訓練(腰背肌功能鍛煉)等方式來緩解患者的疼痛、改善生活質量等。而手術治療主要是通過椎間盤切除術或植入人工椎間盤等方式來治療。然而,保守治療雖然具有創傷小、患者痛苦相對較小、費用低和患者易于接受等優勢,但其療效不穩定且適用范圍也相對較窄。傳統的手術治療方法雖然見效快但也存在著創傷大、后遺癥多等不利因素。因此需要尋求一種新方法延緩IDD的進展,甚至逆轉IDD的進程。

干細胞具有良好的自我更新和分化能力,在實驗室研究和臨床治療中具有廣泛的應用前景。研究表明干細胞可以通過特定的分化途徑修復退變的椎間盤,臨床研究證實干細胞療法治療疼痛性脊柱疾病具有確切療效[4-5],研究者認為通過干細胞治療來激活退變椎間盤的自我修復對于臨床治療IDD至關重要。本文對于干細胞在IDD治療中可能發揮的作用及機制進行綜述,為后續干細胞在IDD治療中的應用提供參考。

1 干細胞治療IDD的理論基礎

IDD通常是由椎間盤內分解和合成過程的不平衡引起的,NP中促進合成代謝的脊索細胞凋亡后致使椎間盤合成不足,進而導致IDD的發生。因此,修復受損的髓核細胞是治療IDD的方法之一。

干細胞是具有多向分化潛能、自我更新能力的細胞,是處于細胞系起源頂端的最原始細胞,在體內能夠分化產生某種特定組織類型的細胞,其修復椎間盤的機制主要是：(1)分化為髓核細胞,修復椎間盤。修復椎間盤的核心在于修復髓核細胞,當正常的髓核細胞受到損傷后,其增殖的潛力有限。研究人員已將干細胞體外誘導分化為髓核樣細胞,可以有效地改善IDD。Binch等[6]成功將人脂肪來源的間充質干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)定向分化為髓核細胞來治療IDD。Daly等[4]通過實驗用MSC促進羊椎間盤切除術模型的腰椎間盤恢復。椎間盤中具有多種生長因子可通過自分泌、旁分泌及內分泌途徑促進MSC向NP分化,同時MSC向NP分化還受到細胞共培養、低氧、三維生物支架、應力變化等影響[7-10]。因此,可通過特定的方式誘導干細胞分化為髓核細胞來修復退變的椎間盤。(2)改善疼痛,調節椎間盤的內環境。干細胞具有分泌多種細胞因子的能力,例如生長因子、營養因子、抑炎因子等。其中,生長因子可誘導退變的椎間盤細胞再生,例如胰島素樣生長因子能夠促進髓核細胞蛋白聚糖及Ⅱ型膠原表達從而對NP基質合成有促進作用[11],成纖維細胞生長因子在退變的纖維環修復過程中有促進作用[12];營養因子可為細胞的合成生長以及細胞外基質合成提供營養支持;抑炎因子可抑制炎癥反應減緩IDD的進程,促進免疫調節,從而改善內環境,緩解疼痛等臨床癥狀[13]。黃曉東等[5]的實驗結果表明在大鼠非壓縮性椎間盤突出模型中,骨髓MSC可通過抑制小膠質細胞的活化來減輕神經根性疼痛,并能夠下調促炎細胞因子的表達。(3)增加血供,改善椎間盤功能。椎間盤本身沒有血液供應,一旦受到損傷,很難進行自我修復。張夏夢等[14]通過動物實驗發現,當椎動脈型頸椎病模型動物接受耳緣靜脈注射骨髓MSC混懸液后,骨髓MSC能上調CD4+CD25+調節性T細胞水平,從而有效抑制椎動脈血管炎癥反應,修復受損椎動脈血管。受損椎動脈血管的恢復,有利于IDD得到更大程度改善,緩解椎間盤的進一步惡化。

2 干細胞治療IDD的現狀

2.1 單純使用干細胞治療IDD的現狀

研究表明,在治療IDD中,干細胞可以有效修復受損的椎間盤組織,從而改善椎間盤功能[4]。干細胞治療較傳統的治療方法而言,具有操作簡單、治療效果持久等優點。MSC可以用于IDD,參與緩解疼痛[15]以及術后預防進一步退變、減少并發癥[16]等。在MSC的供體來源上,有研究者選用自/異體MSC或干細胞外囊泡治療IDD,均有良好的治療效果。Besalti等[16]證明應用自體MSC治療IDD術后預后不良是一種很有前途的方法;Orozco等[17]針對10例IDD患者進行自體骨髓MSC移植,通過隨訪,并對其疼痛評分和殘疾指數進行評估,發現患者的疼痛和殘疾都有所改善。Wang等[18]實驗結果表明,自體MSC-陶瓷復合材料在恒河猴體間融合模型植入3個月后,促進骨再生,實現脊柱骨性融合;Xuan等[19]研究表明,椎間盤切除術聯合自體椎間盤源性細胞移植治療腰椎間盤突出是安全可行的。椎間盤源性細胞移植可以減緩原有IDD的加重,減少椎間盤切除術的并發癥。Noriega等[20]研究表明,異體MSC治療可能是治療IDD的有效選擇,異體MSC治療IDD的優點是：干預簡單,無需手術,可以緩解疼痛,并通過觀察Pfirrmann分級變化發現其可顯著改善IDD。骨髓MSC通過分泌多種生物活性分子來應對局部微環境中的刺激,Distefano等[21]研究表明可以不用外源性干細胞移植而采用人MSC來源的胞外囊泡從而實現椎間盤的無細胞生物活性修復。骨髓MSC可能受到受體的環境改變影響其功能,而干細胞來源的胞外囊泡的因其具有穩定性高等特點,其治療效果更具有可預測性及可控性。這種MSC胞外囊泡的治療策略可能通過刺激細胞增殖、促進細胞遷移、保護細胞免受退行性促炎微環境的影響來實現的。Wang等[22]研究證實人骨髓MSC來源的細胞外囊泡通過SOX4/Wnt/β信號通路促進退化的髓核細胞的增殖和細胞外基質的合成。外泌體屬于細胞外囊泡的一種,Xiang等[23]研究也證實,人尿源性干細胞外泌體通過蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)和細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)信號通路顯著抑制壓力條件下內質網應激誘導的細胞凋亡和IDD。因此,這是一種可行的治療策略。總之,無論是自體干細胞、異體干細胞還是干細胞外囊泡都是治療IDD的可行方法。

2.2 干細胞與生物載體等聯合應用治療IDD

利用生物支架和MSC聯合應用可修復椎間盤缺損,促進其再生。Ukeba等[24]研究表明超純化干細胞與原位形成的生物可吸收凝膠的結合可促進退變椎間盤的修復,干細胞和凝膠聯合增強了嚴重IDD綿羊模型椎間盤切除術后(長達24周)椎間盤的再生。徐寶山等[25]研究發現使用富含骨髓基質細胞的明膠海綿修復腰椎椎間盤切除術后的椎間盤缺損是可行和有效的,因此這值得作為椎間盤修復的細胞療法進行進一步的研究和開發。Guillaume等[26]研究發現增強形狀記憶藻酸鹽-膠原復合支架具有增強細胞遷移和增殖的優勢,可用于增強組織修復。梯度三維細胞包埋水凝膠作為椎間盤組織工程的潛在生物支架,具有與天然椎間盤相似的結構和功能：內部區域模仿NP組織,外部區域模仿層狀纖維環組織,與干細胞聯合應用或能更好的修復椎間盤。研究發現,干細胞的遷移跡象受到哺乳動物椎間盤中細胞外基質結構的影響[27],這對于開發治療IDD的組織工程時是有用的。不過,目前對于這方面的報道較少,開發相關的生物材料需要進一步研究。

研究表明,端粒酶縮短、DNA損傷、氧化應激、微環境和外泌體等因素會誘導干細胞衰老而不利于椎間盤退行性疾病的治療[28-29]。因此可以通過藥物與干細胞聯合應用通過改變椎間盤微環境或提高MSC來源的細胞外囊泡在特定病變微環境中的輸送效率等方式提高干細胞治療能力[30]。左睿等[31]研究發現,炎性細胞因子中的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α可增加細胞內活性氧的水平,引起軟骨終板干細胞衰老和成骨分化;雷帕霉素誘導的自噬增強核因子E2相關因子2(nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)/Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)信號傳導,促進抗氧化蛋白超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)1和 SOD2的表達,從而消除活性氧,緩解干細胞衰老,減少軟骨終板干細胞的成骨分化,保護了軟骨終板干細胞免受TNF-α誘導的氧化應激和細胞衰老的影響。劉建軍等[32]研究表明,酸性條件可以顯著抑制細胞增殖,增加細胞凋亡。基因表達結果也表明,酸性條件可降低干細胞相關基因的表達,抑制細胞外基質的合成,并可增加酸敏感離子通道的表達。因此,在IDD的酸性條件下可以抑制NP中MSC的生物學行為,阿米洛利可以通過提高NP中MSC的活性來改善IDD。王子玉等[33]研究證實Sa12b(一種黃蜂肽)通過抑制酸敏感離子通道,提高嚴重酸性環境下退變NP中MSC的生物活性,延緩IDD,改善腰痛。因此,積極探索更合適的生物載體及藥物也為干細胞治療IDD提供了更多的思路。

3 干細胞治療IDD的問題和挑戰

盡管在干細胞治療IDD的研究和應用中已經取得了許多進展,但是目前如何使用它們以取得更好的效果仍然需要進一步研究。因此未來還需要進一步研究解決有關干細胞類型、細胞來源、植入方法、細胞數量及體積、安全性以及開發更適合的生物載體等諸多問題。

3.1 干細胞類型

不同類型的干細胞具有不同的分化潛能。現有的證據表明多種類型的干細胞對IDD的治療都是有效的,但目前尚不清楚哪種組織來源的干細胞是治療IDD的最佳選擇,干細胞的類型選擇需要進一步的實驗研究與臨床驗證。胚胎干細胞雖然是一類具有無限增殖能力和多種分化潛能的細胞,但由于其倫理方面等原因,目前研究較少也限制了其臨床應用。骨髓MSC來源于骨髓,具有相對容易獲取且具有免疫調節功能,然而它們的分化潛能隨著擴增次數的增加而降低,從骨髓中收集細胞會導致供體部位疼痛。脂肪來源的MSC具有與骨髓來源的MSC相似的特性,并且具有易獲得性和較高的生產效率等優點。Kumar等[34]開展了脂肪干細胞治療IDD的Ⅰ期臨床試驗,該臨床試驗的成功表明了脂肪干細胞治療IDD的有效性和安全性,滑膜來源的MSC比骨髓和脂肪來源的MSC具有更高的分化潛能。然而,滑膜MSC移植治療IDD的有效性尚未見報道,有待進一步的實驗研究。與其他種類干細胞相比,臍帶MSC治療IDD的研究報道較少,還需要對其安全性和有效性進行驗證。龐曉東等[35]通過對11例慢性椎間盤性腰痛患者接受臍帶MSC移植治療,在2年的隨訪期間,發現疼痛視覺模擬評分(visual analogue scale,VAS)和Oswestry功能障礙指數(Oswestry disability index,ODI)明顯下降。因此,移植人臍帶來源的MSC是治療慢性椎間盤性腰痛的良好替代方法。

3.2 干細胞來源

干細胞來源也是臨床治療中必須考慮的問題之一。自體MSC因其具有更高的安全性,在目前的研究中應用廣泛,但因其應用成本較高、臨床應用需等待周期長,同時具有細胞數量有限的缺點。而異體MSC來源廣泛,可提前擴增、提前大量生產與存儲,因此具有成本低、臨床治療效率高等優點。椎間盤內無血供,理論上免疫原性的反應很低,因此可廣泛應用。但是值得注意的是,雖然這一研究領域已經取得了諸多進展,但是實現更加標準化、安全性更高的應用仍然需要大量問題亟待解決。

3.3 移植方法

移植方法是IDD的細胞治療的主要障礙之一,干細胞移植絕大多數是采用椎間盤內注射,而注射過程對操作者有一定的技術要求,否則極有可能導致椎間盤進一步損傷,這可能進一步導致IDD。目前關于干細胞靜脈注射和椎間盤內注射等方法對損傷椎間盤修復的作用研究比較少,Tam等[36]通過實驗研究發現,干細胞靜脈注射和椎間盤內注射后都沒有改善IDD及恢復椎間盤高度,但兩種方式都可能通過旁分泌作用增加了糖胺聚糖蛋白和蛋白聚糖基因的表達。因此,需要大樣本的實驗,來進一步驗證不同移植方法對于IDD的影響,以選擇理想的移植方法。

3.4 其他問題

理想的干細胞移植載體應與人體具有生物相容性,具有椎間盤類似的結構和功能。然而,哪種載體最適合干細胞,且不良反應較少,需要進一步研究。

此外,IDD程度與移植干細胞的數量之間的關系目前研究較少;移植的干細胞是否在局部存活也無長期有效的監測手段;干細胞具有較強的分化潛能,干細胞移植后如何保證正常分化而不產生不良的細胞分化甚至是否會誘導腫瘤的發生還需要進一步研究;異體細胞移植是否會發生免疫排斥也無可靠的證據。而且干細胞移植對于操作者也有一定的要求,否則可能導致椎間盤炎和骨髓炎的發生[37]。總之,在干細胞治療IDD的臨床應用中還存在著諸多問題,需要突破這些問題是解決干細胞治療IDD在臨床中應用的關鍵所在。

4 結 論

隨著人們生活方式的改變以及老齡化程度的加重,IDD患者數量逐漸增加,患者的治療負擔也逐漸加重。目前常用的治療IDD的方法都有著一定的局限性,在經典治療方法的基礎上衍生出一系列的新方法,這些方法補充和完善了IDD治療的許多方面。值得注意的是,雖然干細胞治療IDD在臨床上已取得初步成功,但仍有許多問題有待解決,需要更多的基礎研究和臨床試驗來尋找干細胞分化的潛在分子機制、理想的細胞來源及類型、優化的移植物和移植方法等。隨著研究的不斷深入,相信干細胞可以為IDD患者提供更多的選擇和幫助。