LncRNA TUG1介導Nrf2/HO-1信號通路對脂多糖誘導的心肌細胞凋亡的影響

劉永政 劉曉靜 王俊俠 劉平原 劉淑華

(秦皇島市第一醫院心內科,河北 秦皇島 066000)

在心肌梗死、心肌炎、缺血性心肌病、糖尿病性心肌病等多種心血管系統疾病中均存在心肌細胞凋亡,脂多糖誘導心肌細胞模型具有成模穩定、操作簡單等優點〔1～3〕。長鏈非編碼RNA是與心血管疾病心功能重構、細胞凋亡聯系密切的非編碼RNA,Li等〔4〕和Yang等〔5〕研究發現,牛磺酸上調基因(TUG)1過表達可促進心肌細胞凋亡,而下調TUG1則抑制心肌細胞凋亡。心肌組織正常功能發揮需充足氧氣支持,而當氧氣缺乏時可造成心肌細胞不可逆損傷,進而凋亡。氧化應激在心肌損傷的級聯反應中起到重要作用,核因子E2相關因子(Nrf)2/血紅素氧化酶(HO)-1是對抗氧化應激的主要防御機制〔6〕。基于此,本研究分析LncRNA TUG1介導Nrf2/HO-1信號通路對脂多糖誘導的心肌細胞凋亡的影響。

1 對象與方法

1.1研究材料 研究細胞:心肌細胞HPC2購自上海弘順生物,本次研究經醫院倫理委員會審核批準。主要試劑:RPMI1640培養基(武漢益普生物科技有限公司),脂多糖(上海馮萊生物科技有限公司),LncRNA TUG1沉默載體和上調載體(上海吉瑪制藥技術有限公司),逆轉錄試劑盒、Trizol試劑盒、聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒(上海鈺博生物科技有限公司),酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海富衡生物科技有限公司),二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術公司),天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2相關X蛋白(Bax)、Bcl-2、Nrf2、HO-1抗體(北京中杉金橋生物試劑公司)。

1.2細胞培養及脂多糖處理 將人心肌細胞HPC2放入RPMI1640培養液(10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml酶聯素)中,后放入培養箱(溫度37 ℃、5%CO2),3 d換1次培養液,密度達80%～90%時,除去培養基,進行傳代培養,取3～5代細胞后續實驗。對數期生長心肌細胞接種于6孔板上(2×105個細胞/孔),培育過夜,加入10 mg/L脂多糖,繼續培養6 h。

1.3脂多糖誘導的心肌細胞中LncRNA TUG1表達量檢測 實時熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測各組LncRNA TUG1表達量,Trizol試劑提取細胞中總RNA,總RNA純度、濃度通過超微量核酸蛋白檢測儀進行測量,后合成總cDNA,以cDNA為模板U6為內參,采用Primer5.0軟件設計引物序列,啟動PCR儀,采用2-ΔΔCt方法計算出各組細胞中LncRNA TUG1表達量。試驗重復測量3次。

1.4細胞轉染及轉染效率測定 將對數生長期脂多糖誘導的心肌細胞HPC2接種于6孔板上,每孔1×105個細胞,放入培養箱內(37 ℃ 5% CO2飽和濕度),采用Lipofectamine2000進行轉染,分為對照組、上調組、下調組。對照組不做處理,上調組做LncRNA TUG1上調質粒轉染,下調組做LncRNA TUG1沉默質粒轉染。

1.5細胞凋亡率檢測 各組細胞轉染48 h后,TUNEL法測定細胞凋亡率,將所培養細胞做洗滌、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色封片后的細胞核分別呈現為藍色熒光(陰性細胞數)、綠色熒光(陽性細胞數),之后細胞凋亡情況采用熒光顯微鏡進行觀察,細胞凋亡指數=凋亡細胞數/總細胞數×100%。試驗重復測量3次。

1.6Caspase-3、Bax、Bcl-2及Nrf2/HO-1信號通路相關蛋白表達量檢測 各組細胞轉染48 h后,通過Western印跡法檢測Caspase-3、Bax、Bcl-2、Nrf2、HO-1表達量十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)于每孔加入80 μg蛋白后進行,電泳結束后將蛋白電轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂奶粉對PVDF膜進行封閉,Caspase-3、Bax、Bcl-2、Nrf2、HO-1一抗(1∶1 000)于搖床上室溫孵育,共孵育120 min,完成后采用TBST洗膜3次,5 min/次,后將Caspase-3、Bax、Bcl-2、Nrf2、HO-1二抗(1∶1 000)于搖床上室溫孵育,共孵育60 min,完成后采用TBST洗膜3次,10 min/次,化學發光顯影采用ECL,以GAPDH為內參,相對條帶灰度光密度值采用ImageJ軟件分析。

1.7氧化應激及炎性因子水平檢測 各組細胞轉染48 h后,收集各組細胞培養上清液,3 500 r/min,離心10 min,保留上清液,通過酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法對乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α水平進行檢測。

1.8統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、F檢驗、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.13組脂多糖誘導的心肌細胞LncRNA TUG1表達量對比 如表1所示,與對照組相比,上調組LncRNA TUG1表達量上升,下調組LncRNA TUG1表達量下降,差異具有統計學意義(P<0.05),說明LncRNA TUG1轉染成功。

表1 3組脂多糖誘導的心肌細胞LncRNA TUG1表達及心肌細胞凋亡對比

2.23組脂多糖誘導的心肌細胞凋亡情況對比 如表1所示,與對照組相比,上調組凋亡率、Caspase-3、Bax表達量上升,Bcl-2表達量下降,下調組凋亡率、Caspase-3、Bax表達量下降,Bcl-2表達量上升,差異具有統計學意義(P<0.05);與上調組相比,下調組凋亡率、Caspase-3、Bax表達量下降,Bcl-2表達量上升,差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.33組脂多糖誘導的心肌細胞氧化應激及炎性因子水平對比 如表2所示,與對照組相比,上調組LDH、MDA、IL-6、TNF-α水平上升,SOD水平下降,下調組LDH、MDA、IL-6、TNF-α水平下降,SOD水平上升,差異具有統計學意義(P<0.05);與上調組相比,下調組LDH、MDA、IL-6、TNF-α水平下降,SOD水平上升,差異具有統計學意義(P<0.05)。

表2 3組脂多糖誘導的心肌細胞氧化應激、炎性因子水平及Nrf2/HO-1信號通路相關蛋白表達量對比

2.43組脂多糖誘導的心肌細胞Nrf2/HO-1信號通路相關蛋白表達量對比 如表2所示,與對照組相比,上調組Nrf2、HO-1表達量下降,下調組Nrf2、HO-1表達量上升,差異具有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

脂多糖是具有劑量依賴性細胞毒作用的革蘭陰性菌外膜成分,可造成心力衰竭、心肌損傷,脂多糖誘導的心肌細胞內質網可出現持續性應激反應,激活凋亡途徑,最后造成了心肌細胞凋亡〔7,8〕。本研究結果提示,脂多糖誘導的心肌細胞中LncRNA TUG1呈高表達,下調其表達可抑制心肌細胞凋亡。分析其原因為:長編碼RNA是具有引導核糖酸復合體、介導信號傳導、細胞凋亡等功能的功能性RNA分子,在心血管疾病中可參與心室重構、心肌肥厚、心肌細胞凋亡,在疾病狀態下表達差異性較為明顯。心肌組織中LncRNA TUG1可在缺氧后顯著上調,這樣又加重了心肌細胞的損傷〔9,10〕。將LncRNA TUG1的表達下調后發現小鼠心功能和梗死面積均有明顯改善,表明抑制LncRNA TUG1對發生心梗小鼠的心肌有一定保護作用〔11〕。國內學者通過檢測各組細胞的炎癥因子表達情況,來評估LncRNA TUG1對缺氧心肌細胞炎癥反應的影響提示,抑制lncRNA-TUG1會減輕缺氧心肌細胞的炎癥發生〔12〕。

Caspase-3是可激活核酸內切酶、引發DNA損傷修復酶降解的半胱氨酸蛋白酶,可誘導細胞核染色質的固縮及凋亡小體的產生,為調控細胞凋亡的主要環節,在被激活時可裂解大量底物,造成細胞凋亡〔13,14〕。Bcl-2是對線粒體外膜通透性具有調節作用的抑凋亡基因,Bax為促凋亡基因,心臟在血管氧化應激病理進展期間可出現不同程度的心肌細胞凋亡〔15〕。LDH作為反映細胞損傷情況的細胞毒性指標,在細胞損傷、凋亡中呈高表達,MDA可對氧化應激損傷程度進行反映,SOD可保護細胞免受損傷,在細胞膜經氧化應激破壞后,不飽和脂肪酸受到攻擊,造成MDA生成增加、SOD生成減少〔16,17〕。心肌缺氧、缺血后可造成無菌性炎性反應,聚集免疫細胞,促進IL-6、TNF-α等炎性因子釋放,并引起心肌收縮減弱。有研究報道IL-6、TNF-α可由動脈粥樣硬化斑塊合成,并且作用于血管壁引起損傷,進一步促進血栓的形成和發展〔18,19〕。既往實驗表明,IL-6參與心力衰竭途徑主要通過抑制心肌收縮及促進心肌凋亡,而給予干預可降低大鼠體內IL-6及心肌細胞凋亡〔20〕。有研究指出,TNF-α可使培養鼠心肌細胞凋亡,且凋亡數目與TNF-α呈正比〔21〕。本研究結果提示,下調LncRNA TUG1表達可降低免疫炎癥反應,抑制脂多糖誘導心肌細胞凋亡。

Nrf2/HO-1通路為細胞氧化應激的主要通路,可發揮調節細胞凋亡、減少線粒體損傷、抗氧化、抗炎等作用,在心力衰竭、原發性高血壓、動脈粥樣硬化、心律失常、心肌缺血再灌注損傷等心血管疾病中激活Nrf2/HO-1可發揮保護作用〔22,23〕。Nrf2為減緩抗氧化酶及細胞凋亡的表達以減緩氧化受損的氧化還原的一種轉錄因子,可與keap1形成復合物的重要轉錄因子,在抗氧化反應中具有關鍵作用,當機體出現氧化應激反應時,可集合抗氧化反應原件,后啟動HO-1、NQO1等下游基因,而發揮抗氧化應激作用〔24〕。陶卉等〔25〕通過實驗發現,Nrf2或HO-1過表達可減少內質網應激信號的表達,說明Nrf2/HO-1表達增強可降低細胞凋亡。

在機體與病原體接觸之后,細胞可經程序性死亡以減緩病原體在細胞中的復制能力提升,且細胞死亡激發炎癥反應,釋放出細胞膜受損及內源性的危險信號,使得轉錄因子激活且引導促炎因子水平,進而促使炎癥進展〔26〕。炎癥可使氧化應激加劇,致使細胞損傷及凋亡出現,在應激源顯現時,Nrf2分解且轉移至細胞核促使抗氧化酶HO-1的水平變化,而HO-1在炎癥刺激及抗氧化刺激的細胞預防機制中能參與炎性因子IL-6、TNF-α等的出現,提升HO-1表達以緩解細胞凋亡及損傷〔27〕。本研究結果提示,LncRNA TUG1抑制心肌細胞凋亡的機制可能與Nrf2/HO-1信號通路被激活有關。

綜上所述,脂多糖誘導心肌細胞中LncRNA TUG1呈高表達,經下調LncRNA TUG1干預后脂多糖誘導心肌細胞凋亡率下降,凋亡相關蛋白、氧化應激、炎性因子水平得到調節,其機制可能與Nrf2/HO-1信號通路被激活有關,為臨床心肌損傷靶向治療提供了新方向。