環(huán)氧合酶-2抑制劑對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠胃黏膜的影響

賀清 丁瑞峰 黎敏 陳楠 吳昆 張愛民

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,內(nèi)蒙古 包頭 014010)

選擇性環(huán)氧合酶(COX)-2抑制劑是一種新型非甾體抗炎藥(NSAIDs),塞來昔布對(duì)COX-2受體有較高的選擇性,療效與傳統(tǒng)NSAIDs相當(dāng)且不良反應(yīng)少〔1〕。然而有研究發(fā)現(xiàn)在關(guān)節(jié)炎大鼠中單次大劑量應(yīng)用塞來昔布(100 mg/kg)會(huì)出現(xiàn)類似于傳統(tǒng)NSAIDs胃黏膜損傷〔2〕,使用塞來昔布治療的關(guān)節(jié)炎患者,胃腸道不良事件發(fā)生率為0.34%,布洛芬和萘普生的分別為0.74%、0.66%〔3〕。目前選擇性COX-2抑制劑的安全性仍具有爭(zhēng)議。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型在人類療效的可預(yù)測(cè)性方面已得到證實(shí)〔4〕,因此本實(shí)驗(yàn)通過建立佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型,給予治療量的塞來昔布灌胃,探究其是否加重佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠胃黏膜損傷及機(jī)制,為臨床安全用藥提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組方法 SPF級(jí)成年雄性SD大鼠32只,體質(zhì)量500～600 g,210～240日齡,由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供〔實(shí)驗(yàn)動(dòng)物機(jī)構(gòu)許可號(hào):SCXK(京)2019-0010〕。飼養(yǎng)溫度20～25 ℃,濕度50%～70%,光照周期12 h∶12 h,喂食標(biāo)準(zhǔn)的食物和水。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后,按照體質(zhì)量分層原則隨機(jī)分為4組,每組8只,分別為空白對(duì)照組(正常大鼠+甲基纖維素)、關(guān)節(jié)炎組(關(guān)節(jié)炎大鼠+甲基纖維素)、正常給藥組(正常大鼠+塞來昔布)、關(guān)節(jié)炎給藥組(關(guān)節(jié)炎大鼠+塞來昔布)。每天至少對(duì)動(dòng)物的健康進(jìn)行兩次評(píng)估,對(duì)發(fā)生與實(shí)驗(yàn)無關(guān)不良反應(yīng)的大鼠給予過量水合氯醛處死。實(shí)驗(yàn)操作流程符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用指南》的規(guī)定,遵循包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理操作規(guī)范。

1.2主要試劑及儀器 塞來昔布膠囊(美國(guó)輝瑞公司,國(guó)藥準(zhǔn)字J20140072,批號(hào)AL5873);弗氏完全佐劑(美國(guó)Sigma公司,型號(hào)F5881-10ML,批號(hào)SLCB4664);甲基纖維素(美國(guó)Sigma公司,型號(hào)V900506-250G,批號(hào)WXBD00S9V);反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司);實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增試劑盒(德國(guó)Qiagen公司);瓊脂糖(Agarose,美國(guó)Promega公司);焦碳酸二乙酯(DEPC,美國(guó)Sigma公司);前列腺素(PG)E2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(美國(guó)R&D公司);Real-Time PCR儀(美國(guó)ABI公司,型號(hào):7500 Fast Real-Time PCRABI 7500 fast)。

1.3佐劑性關(guān)節(jié)炎模型的制備 關(guān)節(jié)炎組、關(guān)節(jié)炎給藥組通過右足底皮下注射完全弗氏佐劑200 μl建立類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型,空白對(duì)照組、正常給藥組給予相同劑量生理鹽水。相較于空白對(duì)照、正常給藥組而言,造模3 d后的關(guān)節(jié)炎組、關(guān)節(jié)炎給藥組右后足跖部明顯腫脹,皮溫明顯升高,7 d后繼發(fā)性炎性反應(yīng),表現(xiàn)為耳廓、足趾關(guān)節(jié)踝關(guān)節(jié)不同程度的發(fā)紅、腫脹,活動(dòng)受限,提示造模成功。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 關(guān)節(jié)炎組、關(guān)節(jié)炎給藥組造模1 w后開始給予塞來昔布(20 mg/kg,溶于1%甲基纖維素中,灌胃容積5 ml/kg),灌胃28 d,空白對(duì)照組、正常給藥組給予相同劑量甲基纖維素,藥物均現(xiàn)用現(xiàn)配。實(shí)驗(yàn)第42天開始禁食36 h后,10%水合氯醛0.1 ml/100 mg腹腔注射麻醉處死全部大鼠,取胃組織,用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗干凈。

1.5組織病理學(xué)觀察 從幽門部沿胃大彎剪開,取1 cm×1 cm胃標(biāo)本置4%多聚甲醛固定,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,常規(guī)病理切片,蘇木素-伊紅(HE)染色,光學(xué)顯微鏡觀察。由專人盲法閱片,每個(gè)樣本隨機(jī)計(jì)數(shù) 20個(gè)視野,對(duì)每個(gè)視野按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行單獨(dú)評(píng)分,取20個(gè)視野最后平均數(shù)為最終病理評(píng)分。胃黏膜損傷病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)〔5〕:顯微鏡下觀察胃組織切片1 cm范圍,上皮細(xì)胞及或腺體破壞,計(jì)1分;上層黏膜充血或水腫,計(jì)2分;中、下層黏膜充血、出血性損害,計(jì)3分;深層壞死或潰瘍形成,計(jì)4分;計(jì)算每張切片的累積評(píng)分。

1.6ELISA檢測(cè)胃黏膜PGE2 各標(biāo)本相同部位取胃組織塊稱質(zhì)量50 mg,置凍存管中液氮冷凍保存?zhèn)溆谩０凑誆LISA試劑盒說明測(cè)定胃黏膜PGE2的含量。

1.7RT-PCR檢測(cè)胃組織內(nèi)COX-1和COX-2 mRNA的表達(dá) 各標(biāo)本相同部位取胃組織塊稱質(zhì)量50 mg,置凍存管中液氮冷凍。將組織從液氮中取出研磨成粉,采用Trizol法提取組織總RNA。按M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件:70 ℃ 60 min,70 ℃ 10 min。以cDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成:COX1正向:5′-GCAGGGATACCTCGTCGTTA-3′,反向:5′-GGGCATCCATGCAGTCATTC -3′(197 bp);COX2正向:5′-TACAAGACGCCACATCACCT -3′,反向:5′-GACAGCTGGGAGAATTGTTCA-3′(188 bp);GAPDH正向:5′-GGGTGTGAACCATGAGAAGT-3′,反向:5′- GACTGTGGTCATGAGTCCT -3′(136 bp)。RT-PCR程序設(shè)置:預(yù)變性:94 ℃ 2 min,循環(huán)反應(yīng):94 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s(40個(gè)循環(huán)),最后于72 ℃ 10 min 收集溶解曲線。用2-ΔΔCt計(jì)算各個(gè)樣本目的基因的表達(dá)變化。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行Kruskal-Wallis檢驗(yàn)、Nemenyi檢驗(yàn);數(shù)值采用中位數(shù)(四分位數(shù))表示。

2 結(jié) 果

2.1大鼠一般情況 空白對(duì)照組、正常給藥組直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)大鼠毛發(fā)整齊平順有光澤,活動(dòng)、大便如常,正常給藥組部分出現(xiàn)食欲下降。關(guān)節(jié)炎組、關(guān)節(jié)炎給藥組造模后第3天開始出現(xiàn)右后足紅腫、皮溫升高、關(guān)節(jié)腫脹、變形,第7天達(dá)到高峰,第14天出現(xiàn)對(duì)側(cè)后足腫脹,右后足關(guān)節(jié)僵硬變形,皮下結(jié)節(jié)多而明顯。用藥后關(guān)節(jié)炎給藥組右后足周徑逐漸下降,給藥第2天關(guān)節(jié)炎給藥組部分出現(xiàn)少動(dòng)、易激,部分毛發(fā)失去光澤,無明顯食欲下降等。

2.2胃黏膜病理組織學(xué)觀察及評(píng)分 胃黏膜HE染色示:空白對(duì)照組胃黏膜結(jié)構(gòu)完整,胃小凹和腺體清晰,未見明顯損傷及炎癥反應(yīng);關(guān)節(jié)炎組胃黏膜上皮脫落,血管擴(kuò)張;正常給藥組胃黏膜出現(xiàn)輕度黏膜脫落,范圍較小;關(guān)節(jié)炎給藥組胃黏膜出現(xiàn)深層黏膜損傷,血管擴(kuò)張(圖1)。關(guān)節(jié)炎給藥組胃黏膜損傷評(píng)分較空白組對(duì)照組、正常給藥組明顯增加(P<0.05),但與關(guān)節(jié)炎組無顯著差異(P>0.05)。見表1。

圖1 各組胃病理(HE染色,×400)

表1 各組胃病理評(píng)分、胃黏膜PGE2含量及COX-1、COX-2 mRNA比較〔M(P25～P75),n=8〕

2.3胃黏膜COX-1、COX-2 mRNA的相對(duì)密度 正常給藥組胃黏膜的COX-1、COX-2 mRNA相對(duì)密度與空白對(duì)照組無顯著差異(P>0.05);關(guān)節(jié)炎組COX-1、COX-2 mRNA較空白對(duì)照組和正常給藥組表達(dá)明顯增加(P<0.05);關(guān)節(jié)炎組COX-1、COX-2 mRNA相對(duì)密度與關(guān)節(jié)炎給藥組比較,無顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.4胃黏膜PGE2的含量 正常給藥組胃黏膜PGE2的含量與空白對(duì)照組相比無明顯差異(P>0.05);關(guān)節(jié)炎組、關(guān)節(jié)炎給藥組PGE2與空白對(duì)照組比較均明顯降低(P<0.05);關(guān)節(jié)炎組PGE2顯著低于正常給藥組(P<0.05)。與關(guān)節(jié)炎組比較,關(guān)節(jié)炎給藥組PGE2的含量無明顯差異(P>0.05)。見表1。

3 討 論

選擇性COX-2抑制劑通過保留具有保護(hù)性的COX-1,同時(shí)抑制具有促炎性的COX-2,從而在發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛等作用的同時(shí)避免胃黏膜損傷。COX-1是構(gòu)建型環(huán)氧合酶,存在于大多數(shù)組織中,在炎癥應(yīng)激等情況下可輕度增高〔6〕;COX-2是誘導(dǎo)酶,在健康組織中的表達(dá)水平較低,但可在多種刺激下迅速被誘導(dǎo)。PGE2合成存在兩種:瞬時(shí)型和延時(shí)型。瞬時(shí)型為受到刺激后即合成,延時(shí)型則是在誘導(dǎo)后數(shù)小時(shí)才發(fā)生。這種不同與PGE2合成酶和環(huán)氧合酶有關(guān),PGE2合成酶有3種,胞質(zhì)型PGE合成酶及兩種膜結(jié)合型PGE合成酶(mPGES-1和mPGES-2)〔7〕。COX-1和胞質(zhì)型PGE合成酶協(xié)同維持PGE2的組成性水平,而在炎癥狀態(tài)下由COX-2和mPGES-1負(fù)責(zé)PGE2水平的升高,催化延遲型PGE2產(chǎn)生,且mPGES-1是唯一的誘導(dǎo)酶〔8〕。

本研究表明,治療劑量下塞來昔布對(duì)健康大鼠的胃黏膜幾乎無損害作用,Kato等〔2〕的研究中也證明了這一點(diǎn)。Silverstein等〔9〕研究表明選擇性COX-2抑制劑已安全地用于健康人且不會(huì)引起胃黏膜損傷。關(guān)節(jié)炎組與空白對(duì)照組相比病理評(píng)分明顯增加,且COX-1、COX-2表達(dá)增加,這可能是由于關(guān)節(jié)炎引起的全身慢性炎癥所致。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種全身性自身免疫性疾病〔10〕,劉健等〔11〕研究發(fā)現(xiàn),佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠胃黏膜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變,表現(xiàn)為線粒體腫脹變性,棘突破壞或消失,細(xì)胞凋亡率高于正常大鼠,這可能是關(guān)節(jié)炎大鼠胃黏膜損傷的原因之一。Kato等〔2〕表明,COX-2主要在關(guān)節(jié)炎大鼠胃黏膜巨噬細(xì)胞中表達(dá),并且胃黏膜血管通透性較正常大鼠有所增加,關(guān)節(jié)炎大鼠本身患有慢性全身炎癥,胃黏膜中COX-2的表達(dá)和巨噬細(xì)胞數(shù)量的增加可能與此有關(guān)。PGE2通過增加胃黏膜微血管血流量和黏液分泌、抑制白細(xì)胞黏附血管內(nèi)皮等參與消化道黏膜微循環(huán)的調(diào)節(jié)和損傷的修復(fù)〔12〕,本研究發(fā)現(xiàn),關(guān)節(jié)炎大鼠PGE2的含量較空白對(duì)照組大鼠明顯下降,推測(cè)可能與其在胃黏膜修復(fù)過程中的消耗有關(guān)。Takeuchi〔13〕指出,PGE2通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)和激活前列腺素4受體刺激血管生成,對(duì)胃黏膜損傷有促進(jìn)愈合的作用。血管生成是愈合過程的關(guān)鍵,受促血管生成因子(如VEGF)和抗血管生成因子(如內(nèi)皮抑素)的調(diào)節(jié),這種情況在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎〔14〕和實(shí)驗(yàn)性潰瘍〔15〕愈合中均存在。因此關(guān)節(jié)炎黏膜局部PGE2減少,內(nèi)皮抑素與VEGF的比值增加,也會(huì)使損傷胃黏膜愈合受到限制。Kato等〔2〕通過誘導(dǎo)較敏感的深色刺豚鼠(DA大鼠)建立關(guān)節(jié)炎模型,發(fā)現(xiàn)單次大劑量使用塞來昔布(100 mg/kg)雖在正常大鼠中不會(huì)造成胃黏膜損傷,但在關(guān)節(jié)炎大鼠中確實(shí)會(huì)造成類似于傳統(tǒng)NSAIDs藥物的胃黏膜受損。而我們觀察到應(yīng)用治療劑量塞來昔布的SD關(guān)節(jié)炎大鼠,并不會(huì)加重關(guān)節(jié)炎所致的胃黏膜損傷,這與Blackler等〔16〕研究一致,他們發(fā)現(xiàn)接受塞來昔布(10 mg/kg,2次/d,14 d)灌胃的關(guān)節(jié)炎大鼠其胃黏膜損傷程度可以忽略不計(jì),推測(cè)這些損傷差異可能與藥物具體的種類、劑量、用藥時(shí)間、實(shí)驗(yàn)鼠種等有一定的關(guān)系。

綜上,塞來昔布不會(huì)造成正常大鼠胃黏膜損傷,也不會(huì)加重關(guān)節(jié)炎大鼠胃黏膜損傷,在考慮整個(gè)胃腸道的安全性時(shí),目前研究支持使用昔布類而不是傳統(tǒng)NSAIDs。然而,使用該藥物應(yīng)與心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)相平衡,尤其是在心血管疾病高風(fēng)險(xiǎn)患者中。必要時(shí)應(yīng)規(guī)定傳統(tǒng)NSAID或“昔布類”的最短持續(xù)時(shí)間和最低有效劑量〔17〕。