梔子醇提物下調lncRNA MALAT1影響帕金森病模型細胞增殖和凋亡

叢向陽 向艷麗 陳靜

(威海市立第三醫院 1藥劑科,山東 威海 264200;2公共衛生科;3西藥房)

帕金森病(PD)是影響中老年人健康的第二大神經性神經退行性疾病,以大腦黑質中多巴胺能神經元的逐漸喪失,繼而引發運動功能障礙及一系列非運動癥狀為特征〔1〕。雖然多巴胺激動劑、單胺氧化酶B抑制劑可緩解PD的運動癥狀,但并不能阻止疾病進展或逆轉神經退行性變,且長期服用具有較大的副作用〔2〕。梔子為茜草科植物梔子的干燥成熟果實,除用作天然黃色染料外,其還具有抗氧化、降血糖、抑制炎癥、抗抑郁、改善睡眠質量等多種生物活性〔3〕。梔子醇提物可降低PD小鼠的爬桿時間,具有較好的多巴胺能神經元保護作用〔4〕。近年來,長鏈非編碼RNA(lncRNA)在神經發育、再生和神經退行性疾病過程中的作用已成為研究熱點。有研究指出lncRNA肺癌轉移相關轉錄本(MALAT)1在PD模型小鼠腦組織中表達增加并誘導多巴胺能神經細胞凋亡〔5〕。然而,梔子醇提物是否通過調控lncRNA MALAT1表達進而對PD神經元損傷具有保護作用并不清楚。本研究以1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)處理人神經母細胞瘤SK-N-SH細胞構建PD細胞模型〔6〕,探討梔子醇提物對PD模型細胞活力、凋亡的影響,分析其潛在作用機制,以期為開發梔子醇提物用于防治PD提供理論依據。

1 材料與方法

1.1細胞和主要試劑 人神經母細胞瘤細胞SK-N-SH購于武漢普諾賽生命科技公司;MPP+購于美國Sigma公司;MALAT1小干擾RNA(si-MALAT1)、小干擾RNA陰性對照(si-NC)、空載體質粒(pcDNA)、MALAT1過表達質粒(pcDNA-MALAT1)由廣州復能基因公司提供;細胞計數試劑盒(CCK-8)購于日本同仁公司;膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購于上海鈺博生物公司;山羊抗兔IgG二抗及兔抗人B細胞淋巴瘤(Bcl)-2抗體、兔抗人Bcl相關X蛋白(Bax)抗體、兔抗人磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體購于上海碧云天生物公司;逆轉錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix購于美國ABI公司。

1.2梔子醇提物制備 參照張奇昌等〔4〕實驗方法進行,將2 kg梔子干燥果實粉碎,60%乙醇冷浸,收集提取液,負壓抽濾除去雜質,減壓濃縮后,冷凍干燥得到梔子醇提物。

1.3實驗分組 用含10%胎牛血清的MEM培養液在37 ℃、含5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養SK-N-SH細胞。以正常培養的SK-N-SH細胞作為對照組;用3 mmol/L的MPP+處理SK-N-SH細胞18 h作為PD細胞模型〔6〕,記為模型組;用濃度分別為25、50、100 μg/ml的梔子醇提物預處理4 h后再用3 mmol/L的MPP+處理,依次記為實驗1組、實驗2組、實驗3組。利用Lipofectamine2000將si-NC、si-MALAT1分別轉染至SK-N-SH細胞后再用3 mmol/L的MPP+處理依次記為si-NC組、si-MALAT1組。利用Lipofectamine2000將pcDNA、pcDNA-MALAT1分別轉染至SK-N-SH細胞后用100 μg/ml的梔子醇提物預處理4 h及3 mmol/L的MPP+處理依次記為實驗3+pcDNA組、實驗3+pcDNA-MALAT1組。

1.4CCK-8檢測細胞活力 將各組細胞以1×104個/孔密度接種96孔板,每孔加入10 μl的CCK-8試劑,進一步孵育4 h后,分光光度法吸光度測量各孔在450 nm處光密度(OD)值。

1.5流式細胞術檢測細胞凋亡 預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次,隨后用結合緩沖液調整密度為1×106個/ml細胞懸液。采用Annexin Ⅴ-FITC和PI進行染色,流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.6Western印跡檢測Bax和Bcl-2蛋白表達 RIPA裂解液提取各組細胞蛋白質,隨后進行蛋白濃度測定。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后,然后轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂牛奶封閉膜,將膜與兔抗Bax、Bcl-2或GAPDH抗體孵育過夜,然后用山羊抗兔二抗孵育膜2 h?；瘜W發光試劑檢測條帶,以內參和目的蛋白灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。

1.7實時熒光定量-聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測lncRNA MALAT1表達 用Trizol試劑從各組細胞中提取總RNA,逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應,使用SYBR Premix master mix進行RT-qPCR。以GAPDH為內源對照,2-ΔΔCt方法計算lncRNA MALAT1相對表達水平。MALAT1上游引物5′-TGCG AGTTGTTCTCCGTCTA-3′,下游5′-TATCTGCGGTT TCCTCAAGC-3′;GAPDH上游引物5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′,下游5′-AAGTGGTCGTTGAGG GCAATG-3′。

1.8統計學分析 采用SPSS20.0進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析和LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1梔子醇提物對PD模型細胞活性的影響 與對照組比較,模型組細胞活力顯著降低(P<0.05);與模型組比較,實驗2、實驗3組細胞活力顯著升高(P<0.05)。且實驗1、實驗2、實驗3組兩兩比較細胞活力差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 梔子醇提物對PD模型細胞活性、凋亡、MALAT1表達的影響

2.2梔子醇提物對PD模型凋亡的影響 與對照組比較,模型組細胞Bax蛋白表達、凋亡率顯著升高,Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05);與模型組比較,實驗2、實驗3組細胞Bax蛋白表達、凋亡率顯著降低,Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.05)。且實驗1、實驗2、實驗3組間各項指標兩兩比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖1、圖2。

圖1 梔子醇提物對PD模型細胞凋亡的影響

1～9:對照組、模型組、實驗1組、實驗2組、實驗3組、si-NC組、si-MALAT1組、實驗3+pcDNA組、實驗3+pcDNA-MALAT1組

2.3梔子醇提物對PD模型細胞MALAT1表達的影響 與對照組比較,模型組細胞中MALAT1表達顯著升高(P<0.05);與模型組比較,實驗2、實驗3組細胞MALAT1表達顯著降低(P<0.05)。且實驗1、實驗2、實驗3組間MALAT1表達兩兩比較差異有統計學意義。見表1。

2.4抑制MALAT1表達對PD模型細胞活性及凋亡的影響 與si-NC組比較,si-MALAT1組細胞中MALAT1表達水平顯著降低,Bcl-2蛋白表達和細胞活力顯著升高,Bax蛋白表達和凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖2、圖3、表2。

圖3 抑制MALAT1對PD模型凋亡率的影響

表2 抑制MALAT1對PD模型細胞活性及凋亡蛋白的影響

2.5過表達MALAT1對梔子醇提物處理的PD模型細胞活性的影響 與實驗3+pcDNA組比較,實驗3+pcDNA-MALAT1組細胞中MALAT1表達顯著升高,細胞活力顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 過表達MALAT1對梔子醇提物處理的PD模型組細胞活性、凋亡率及凋亡蛋白的影響

2.6過表達MALAT1對梔子醇提物處理的PD模型細胞凋亡的影響 與實驗3+pcDNA組比較,實驗3+pcDNA-MALAT1組細胞Bax蛋白表達和凋亡率顯著升高,Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖2、表3、圖4。

圖4 過表達MALAT1對梔子醇提物處理的PD模型組細胞凋亡率影響

3 討 論

梔子的神經保護作用已被廣泛報道。Zhang等〔7〕研究發現,梔子醇提物可顯著提高腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)含量,抑制乙酰膽堿酯酶(AchE)和一氧化氮合酶(NOS),改善慢性腦缺血模型大鼠學習記憶。Zang等〔8〕指出,藏紅花素能增強抗氧化能力,減輕神經炎癥,增強了阿爾茨海默病(AD)模型小鼠的記憶和認知能力。此外,Yuan等〔9〕證實,梔子苷通過抑制絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)/核因子(NF)-κB通路可維持血腦屏障完整性,降低腦水腫,抑制促炎因子分泌對創傷性腦損傷具有保護作用。本研究表明,梔子醇提物呈劑量依賴效應提高模型細胞活力,抑制模型細胞凋亡。促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2之間的平衡在調控細胞凋亡中起重要作用,Bax表達增加可促進線粒體膜孔形成,導致細胞色素c等促凋亡因子釋放進入細胞質,進而激活半胱天蛋白酶(Caspase)途徑,促進細胞凋亡,而Bcl-2則通過阻止Bax移位線粒體外膜和構象改變具有抗凋亡作用〔10〕。研究證實,MPP+處理可干擾Bax和Bcl-2之間的平衡,促進多巴胺能神經元細胞凋亡〔11,12〕。本研究發現模型細胞中Bax蛋白表達顯著升高,Bcl-2蛋白表達顯著降低,而一定劑量梔子醇提物可顯著逆轉MPP+引起的Bax和Bcl-2表達改變。以上研究結果表明,梔子醇提物可促進PD模型細胞增殖,抑制細胞凋亡,即梔子醇提物具有潛在的PD保護作用。

研究表明,lncRNA是由長度大于200個核苷酸組成的RNA轉錄本,其在轉錄、表觀遺傳和轉錄后水平參與調節神經發育、神經分化、突觸功能等多種生物學過程,在PD發病過程中具有重要作用〔13〕。研究顯示,癲癇大鼠腦組織中lncRNA MALAT1表達增加,并具有誘導細胞凋亡及神經元損傷作用〔14〕。黃連素通過抑制lncRNA MALAT1表達影響miR-181c-5p/高遷移率族蛋白(HMG)B1途徑降低腦缺血后的炎癥損傷〔15〕。然而,脊髓損傷、AD等疾病中lncRNA MALAT1表達降低,過表達lncRNA MALAT1可抑制神經元凋亡和損傷〔16～18〕。本研究顯示,PD模型細胞中lncRNA MALAT1表達顯著升高,而梔子醇提物呈劑量依賴方式降低PD模型細胞中lncRNA MALAT1表達水平。轉染si-MALAT1進行功能驗證顯示,抑制lncRNA MALAT1可提高PD模型細胞活力和Bcl-2蛋白水平,降低細胞凋亡率和Bax蛋白表達水平。進一步研究顯示,轉染pcDNA-MALAT1過表達lncRNA MALAT1可顯著逆轉梔子醇提物對PD模型細胞活力、凋亡及Bax和Bcl-2蛋白的影響。以上研究結果表明,抑制lncRNA MALAT1表達是梔子醇提物對PD模型細胞發揮保護作用的重要途徑。

綜上,梔子醇提物可促進PD模型細胞增殖,抑制細胞凋亡,其機制與下調lncRNA MALAT1表達有關,這豐富了梔子醇提物的神經保護作用機制,為開發梔子醇提物用于防治PD提供理論依據。