四君子湯對胃癌腫瘤干細胞標志物活性及TFAP4蛋白的作用機制

馮金華 劉亞江 顏慧玲 王姿雅

(1郴州市第一人民醫院,湖南 郴州 423000;2郴州市第二人民醫院;3郴州市桂陽縣第一人民醫院)

胃癌是全球常見的消化系統惡性腫瘤,現階段隨著醫療技術的進步胃癌臨床治療方法具有多樣化且患者生存率得到了明顯改善。但是流行病數據顯示胃癌患者復發率較高是導致患者死亡的主要原因,因此減少胃癌患者復發及轉移對于提高預后有重要意義〔1〕。目前,隨著分子生物學及基因學的快速發展,人們對胃癌有了更深入的了解及認識,可以為臨床提供更合理的治療策略。腫瘤干細胞是腫瘤組織內一類具有干細胞特性的細胞,可以以有絲分裂的方式進行不對稱分離,促使瘤體擴大〔2〕。胃癌腫瘤干細胞2009年被首次提取,并證實是以CD44+表達特征的體外培養出現球星集落的細胞,小鼠皮下種植可成瘤。CD44+及CD133均為胃癌干細胞活性標志物,日本一項實驗證實在胃癌大鼠中增加CD44蛋白可增加抑癌基因p53的失活,是胃癌病理生理過程重要環節。王帥〔3〕研究表示,CD133可以通過調節細胞凋亡蛋白B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)活性而增加胃癌細胞耐藥。轉錄因子激活增強子結合蛋白(TFAP)4在機體組織廣泛表達,可與DNA結合轉錄后對相關因子進行調控〔4〕。已經證實,TFAP4在多種腫瘤組織中呈現高表達,如大腸癌、肝癌及胃癌等。文獻證實,TFAP4-小干擾RNA(siRNA)可通過調節Yes相關蛋白(YAP)而抑制胃癌細胞侵襲及遷移,因此通過抑制TFAP4表達可能成為胃癌疾病的治療靶點〔5〕。中醫藥在腫瘤疾病的治療中優勢巨大,四君子湯是由多味中草藥組成的古方劑,主治脾胃氣虛,該方已經成為治療脾胃氣虛的基礎方〔6〕。有報道證實,四君子湯可以誘導胃癌細胞凋亡,但是對胃癌干細胞的影響還無研究,本文以此作為創新點,觀察四君子湯對胃癌干細胞標志物活性及TFAP4水平的影響,為胃癌治療提供藥物參考依據。

1 材料與方法

1.1細胞來源及培養 SGC-7901胃癌細胞株購于南京凱基生物科技發展有限公司。SGC-7901細胞置于顯微鏡下觀察有無污染,放入37 ℃、5%CO2飽和濕度下培養,24 h后棄去培養體后加入含有1%雙抗的10%胎牛血清中培養,培養條件同上。顯微鏡下觀察SGC-7901細胞生長至80%～90%時進行傳代,75%乙醇消毒,棄去舊的培養基,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,加入0.25%胰蛋白酶消化,生長至90%時終止反應,脫壁后,放入15 ml的離心管中1 000 r/min,離心5 min后,棄去上清液放入培養基中2～3 d傳代。

1.2藥物 四君子湯:人參(五加科植物人參 Panax ginseng C.A.Mey.的干燥成熟根,產地遼寧)、白術(菊科草本植物白術 Atractylodes macrocephala Koidz.的成熟干燥根莖,產地江蘇)、茯苓〔多孔菌科茯苓 Poria cocos(Schw.) Wolf 的干燥菌核,產地湖南〕、炙甘草(蝶形花亞科植物甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根莖,產地新疆)按照2∶2∶2∶1比例制成,成分由醫院藥學部主任鑒定。

1.3主要試劑及儀器 DMEM培養基、DMEM/F12培養基購自中國上海微科生物;胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、CCK-8、二甲基亞砜(DMSO)試劑均購自北京索萊寶科技有限公司;鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體、兔抗人Bax、Bcl-2單克隆抗體、兔抗人TFAP4單克隆抗體均購自中國上海圻明生物科技;山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G及山羊抗小鼠IgG購自中國武漢純度生物科技;儀器:電子天平購自中國上海眾淵實業;高溫滅菌鍋購自中國濟南卓隆生物科技;TDZ4-WS 低速臺式離心機購自中國湖南湘瑞生物;倒置顯微鏡購自中國上海豫光儀器;凝膠成像系統及Western印跡電泳系統均購自中國背景賽百奧科技。

1.4SGC-7901干細胞培養 取對數生長的SGC-7901細胞經胰蛋白酶消化后制備出單細胞懸液,PBS沖洗后,將2 000個細胞接種6孔板中,添加含有人類細胞抗原B27、無血清添加劑(N-2)、表皮生長因子(EGF)及堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的DMEM/F12培養基每孔約2 ml,在37 ℃5% CO2中培養。培養3 d觀察細胞呈現球形生長,加入新鮮培養基以維持細胞生長。

1.5含藥血清的制備 20只SD成年雄性大鼠,體質量240～260 g,鼠齡4～5 w,在廣東省醫學實驗動物中心購買。動物許可證號:SYXK(粵)2017-0026,在通風且干凈的環境中對大鼠進行飼養,5只大鼠1個籠子,溫度23 ℃左右,濕度50%左右,黑夜白晝交替循環,自由進食標準顆粒飼料,飲干凈飲用水。所有實驗動物于開始實驗前,適應環境飼養1 w。20只大鼠隨機分為空白組及含藥血清組,每組10只,根據人與大鼠體質量換算各組給藥量〔6〕,含藥血清組灌胃0.01 ml/(g·d)的四君子湯,空白組給予0.9%的生理鹽水灌胃。單日喂藥2次,持續喂藥1 w后,末次給藥后無菌條件下心臟取血,分離血清,用0.22 μm微孔濾膜除菌后分裝于1.5 ml離心管內,逐級凍存,在-80 ℃條件下保存備用。

1.6SGC-7901干細胞形態觀察及集落形成能力 將SGC-7901干細胞置于倒置纖維鏡下觀察形態。集落形成能力:SGC-7901干細胞采用移液器吹打細胞球成單個細胞,收集單細胞懸液后,接種100 mm的培養皿中,貼壁消化SGC-7901也接種到100 mm培養皿中,采用培養基培養2 d后,PBS沖洗,采用4%的多聚甲醛固定紫染色10 min,PBS沖洗,至細胞集落清晰可見,拍照記錄,任意取3個視野計數大于50個細胞的集落數,進行統計分析。

1.7分組及處理 SGC-7901干細胞分為A組(對照組,SGC-7901干細胞在150 μl 10%大鼠空白血清培養基培養)、B組(四君子湯低劑量組,SGC-7901干細胞在75 μl 2.5% 大鼠四君子湯含藥血清中培養)、C組(四君子湯中劑量組,SGC-7901干細胞在75 μl 5% 大鼠四君子湯含藥血清中培養)、D組(四君子湯高劑量組,SGC-7901干細胞在75 μl 7.5% 大鼠四君子湯含藥血清中培養)及E組(5-氟尿嘧啶組,SGC-7901干細胞+含有1 mg/ml的5-氟尿嘧啶培養基中培養)。

1.8CCK-8檢測各組細胞增殖率 6孔板中每孔均加入150 μl SGC-7901干細胞懸液,細胞數目為5×103個/孔,每組設置6孔,加入CCK-8試劑(5 g/L),每孔20 μl,遮光條件下加入200 μl DMSO溶液,輕微搖晃15 min后促使充分溶解后,在24、48、72及96 h時在波長490 nm檢測吸光度(OD值)。

1.9流式細胞儀檢測細胞凋亡 將0.25%蛋白酶消化的SGC-7901干細胞,接種到無牛血清培養基過夜,24 h后收集細胞,每組選擇3個樣本,PBS洗滌1次,100 μl接種于5 ml流式試管中,5 μl的異硫氰酸熒光素(FITC)膜聯蛋白(Annexin)Ⅴ與5 μl碘化丙啶(PI)混合后染色,無光條件下,孵育15 min后注入400 μl 結合緩沖鹽混勻,予以洗滌,次數3次,后采用流式細胞儀分析細胞凋亡程度。

1.10免疫印跡檢測SGC-7901干細胞標志物CD44、CD133、Bax、Bcl-2及TFAP4蛋白水平 SGC-7901干細胞移入6孔板中,細胞濃度為2.5×104個ml,PBS沖洗,加入150 μl放射免疫沉淀(RIPA)的裂解液,12 000 r/min離心15 min后,進行電泳實驗。聚偏氟乙烯(PVDF)膜Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBS)浸泡10 min,反復PBS沖洗,5 min/次,加入CD44(1∶500)、CD133(1∶500)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)及TFAP4(1∶500)1抗和內參GAPDH抗體(1∶1 000),TBS沖洗3次后,加入辣根過氧化酶標記的山羊抗兔(1∶5 000),雜交沖洗。后將膜浸入電化學發光(ECL)工作液,隨后進行檢測,獲取圖像。

1.11統計學分析 采用GraphPad Prism8軟件進行方差分析、Bonferroni法。

2 結 果

2.1SGC-7901干細胞形態改變 SGC-7901干細胞隨著生長周期的延長,球體逐漸增大,3 d時體積較小結構松散,4 d時細胞呈現橢圓形生長,5 d時細胞結構更致密,形態更加接近球形,且一個球體所包含細胞數目可達到數十個,見圖1。

圖1 SGC-7901干細胞形態(免疫熒光染色,×40)

2.2SGC-7901細胞及SGC-7901干細胞集落形成能力 SGC-7901及SGC-7901干細胞的細胞集落分別為(12.25±2.50)、(34.60±3.14)個,組間比較存在顯著差異(t=13.640,P<0.001),見圖2。

圖2 SGC-7901細胞及SGC-7901干細胞集落形成能力比較(結晶紫染色)

2.3四君子湯對SGC-7901干細胞活性的影響 CCK-8結果顯示:與A組相比,B組、C組、D組及E組24、48、72及96 h時SGC-7901干細胞活性均顯著降低(均P<0.05);與B組相比,C、D、E組上述時間細胞活性明顯降低(P<0.05);與C組相比,D、E組上述時間細胞活性明顯降低(P<0.05),D組和E組比較無統計學意義(P>0.05),見表1。

表1 各組不同時間SGC-7901干細胞活性及干細胞標志物活性比較

2.4四君子湯對SGC-7901干細胞凋亡率的影響 A組、B組、C組、D組及E組SGC-7901干細胞凋亡率分別為(7.08±0.50)%、(13.70±1.51)%、(19.44±2.20)%、(27.03±2.69)%及(28.10±2.55)%,組間比較存在顯著差異(F=112.900,P<0.001),進一步比較,與A組比較,B組、C組、D組及E組凋亡率均顯著升高(P<0.05),與B組比較,C、D、E組顯著升高(P<0.05);與C組比較,D、E組顯著升高(P<0.05),D組和E組比較無統計學意義(P>0.05),見圖3。

圖3 各組SGC-7901干細胞凋亡率

2.5四君子湯對SGC-7901干細胞標志物CD44及CD133活性的影響 與A組比較,B組、C組、D組及E組CD44及CD133蛋白表達均顯著降低(P<0.05);與B組相比,C、D、E組CD44及CD133顯著降低(P<0.05);與C組相比,D、E組CD44及CD133顯著降低(P<0.05),D組與E組比較無統計學意義(P>0.05),見表1、圖4。

圖4 各組SGC-7901干細胞標志物CD44及CD133蛋白表達

2.6各組SGC-7901干細胞Bax、Bcl-2及TFAP4蛋白比較 與A組比較,B組、C組、D組及E組Bax增加,Bcl-2及TFAP4降低,組間比較存在顯著差異(P<0.05);與B組比較,C、D、E組Bax顯著增加,Bcl-2及TFAP4顯著降低(P<0.05);與C組相比,D、E組Bax顯著增加,Bcl-2及TFAP4顯著降低(P<0.05),D組與E組比較無統計學意義(P>0.05),見表2、圖5。

表2 各組SGC-7901干細胞Bax、Bcl-2及TFAP4蛋白水平比較

圖5 各組SGC-7901干細胞Bax、Bcl-2及TFAP4蛋白

3 討 論

胃癌干細胞是胃癌組織中存在數量極少的腫瘤干細胞,自我更新能力強可以無限增殖且存在多向分化的可能。研究發現,在胃癌細胞中加入EGF及bFGF后可以增加胃癌細胞成球能力,接種到小鼠皮下幾個月后可成瘤,與普通胃癌相比具有更強的成瘤能力〔7〕。有學者認為,腫瘤干細胞可能是胃癌患者復發及轉移的根源,因此如何殺傷胃癌干細胞是臨床治療關鍵〔8〕。本文證實,四君子湯對胃癌干細胞具有抑制作用,研究機制與調控TFAP4相關。

胃癌SGC-7901干細胞隨著生長周期的延長,初期體積較小結構松散,隨著時間延長細胞呈現橢圓形生長,細胞結構致密,形態更加接近球形。與SGC-7901細胞相比,SGC-7901干細胞在無血清條件下懸浮培養后,集落形成能力較強,可形成瘤體,而SGC-7901細胞卻不能。本文結果說明,四君子湯具有抗胃癌干細胞活性作用。

腫瘤干細胞學說認為,腫瘤干細胞與普通腫瘤細胞相比具有增殖速度快的特點,且其特點可增加對抗化療藥物敏感性導致臨床療效降低。近些年,研究發現炒白術、黨參及四君子湯等健脾扶正藥物可以發揮抗胃癌活性的作用,促使胃癌細胞核固縮而加快凋亡〔9〕。中醫將胃癌歸屬為“胃脘痛”的范疇,病因病機與機體為內虛外感風邪,加之情志不暢飲食損傷導致陰陽失調,臟腑功能失常而導致一系列病理改變,臨床應采用扶正祛邪、補脾益氣為主,輔以祛濕化瘀、消癰散結等辨證論治〔10〕。四君子最早記載于《太平惠民和劑局方》,由人參、白術、茯苓及甘草組成具有益氣健脾及扶正固本的作用,可針對脾胃虛弱病癥有較好的治療作用。人參是臨床廣泛應用的抗腫瘤藥物,人參中有效活性成分包含人參多糖、人參皂苷等均具有抗腫瘤作用。在骨肉瘤干細胞中人參皂苷有顯著抑制增殖作用。白術為菊科蒼術屬植白術,具有除燥利濕及健脾補氣的作用。李小芳等〔11〕研究認為白術可通過多種途徑發揮抗腫瘤作用,主要與介導凋亡信號通路而減少胃癌腫瘤細胞增殖,加快凋亡有關。茯苓歸脾、腎經,具有健脾、利尿滲濕及寧心之功效。茯苓抗腫瘤成分主要為茯苓多糖及茯苓三萜類,并已經證實茯苓多糖可以抑制胃癌小鼠瘤體體積。CD44及CD133是近些年胃癌干細胞最常見的標志物〔12〕,在胃癌干細胞均為有膜結構的受體,可以直接表達于腫瘤細胞膜上,可以利用這一特點直接進行靶點治療〔13〕。CD44及CD133表達具有非特異性,在胃癌、卵巢癌、乳腺癌等中呈現高表達,認為兩者表達的下游相關信號通路可能對多種惡性腫瘤生長機制存在研究價值〔14〕。本文研究發現,四君子湯可以對胃癌干細胞標志物CD44及CD133具有抑制作用。四君子湯中人參為君藥,益氣、健脾及養胃功效。白術為臣藥可發揮健脾燥濕,益氣助運的作用。茯苓與白術相互匹配健脾祛濕之功更顯著。炙甘草調和諸藥,共同發揮補益氣血、益氣健脾的作用。以往研究證實,四君子湯可以加快乳腺癌干細胞凋亡,機制與四君子湯可以抑制程序性死亡受體配體(PD)-L1表達相關〔15〕。

本文結果說明,四君子湯具有調控細胞凋亡信號而加快腫瘤細胞凋亡的作用。Bax/Bcl-2是目前研究最廣泛的細胞凋亡信號通過,兩者可通過形成同源或異源二聚體進而調節細胞凋亡〔16〕。在胃癌干細胞中Bax促凋亡因子表達降低,Bcl-2抗凋亡因子表達激活而加快腫瘤發生發展〔17〕。TFAP4是近些年發現的新型重要轉錄因子,可通過與原癌基因c-MYC 蛋白結合后抑制抑癌基因p21活性而參與胃癌發展,TFAP4高表達的胃癌患者預后更差〔18〕。張悅等〔19〕研究表示,TFAP4可加快胃癌細胞侵襲及遷移,而當沉默TFAP4后可降低胃癌細胞間質轉化,這與調控 YAP信號相關。劉瑞〔20〕實驗證實,四君子湯對胃癌細胞中細胞凋亡基因具有影響,表現在隨著四君子湯濃度的增加Bax增加Bcl-2降低,說明可以通過調控該信號通路而抑制癌細胞增殖。本文推測四君子湯可能是通過抑制TFAP4蛋白表達而調節Bax/Bcl-2信號的,認為與四君子湯可以抑制胃癌干細胞活性而降低成瘤能力相關,但是具體研究機制還不清楚,需要進一步研究證實。

本文存在一定不足之處,關于四君子湯對TFAP4抑制機制還需要進一步證實,今后需要加強實驗內容及單位合作,完善其作用機制,為臨床研究提供實踐基礎。