辣木葉通過NF-κB 通路介導(dǎo)血管性癡呆小鼠mTOR、Cdc42的表達(dá)對學(xué)習(xí)記憶功能及海馬神經(jīng)元的保護(hù)機(jī)制

劉媛媛 孫楊 李超 尹帥 隋月林 張海峰 劉冀

(1滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校解剖教研室,河北 滄州 061001;2河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院)

血管性癡呆(VD)是全球第二大最常見的癡呆形式,是由腦血管疾病引起,患者往往表現(xiàn)出高級認(rèn)知能力的嚴(yán)重?fù)p害〔1〕。氧化應(yīng)激反應(yīng)是引起VD患者海馬神經(jīng)元凋亡損害學(xué)習(xí)、記憶功能的重要病理基礎(chǔ),核因子(NF)-κB 作為一種關(guān)鍵性因子,在細(xì)胞受到氧化應(yīng)激等信號刺激后被活化〔2〕。研究報道在大鼠腦缺血模型中,海馬NF-κB表達(dá)升高,進(jìn)而誘導(dǎo)過量興奮性氨基酸,導(dǎo)致神經(jīng)元損傷,同時釋放氧化自由基、一氧化氮,引起細(xì)胞的毒性損害〔3〕。因此抗氧化也是治療VD的主要策略。作為一種天然藥物,辣木葉具多種生物學(xué)活性,包括抗糖尿病、抗炎、抗癌、抗缺血、抗瘧原蟲等〔4〕。研究顯示辣木葉可體外保護(hù)牛乳腺上皮細(xì)胞免受過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷〔5〕。也有研究發(fā)現(xiàn)辣木葉提取物能夠減輕同型半胱氨酸誘導(dǎo)的阿爾茨海默病動物模型的神經(jīng)損傷,緩解認(rèn)知障礙〔6〕。但辣木葉對VD的作用尚不明確。本研究基于氧化應(yīng)激反應(yīng)分析辣木葉對改善VD小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 SPF級雄性BALB/c小鼠,6～8周齡,體質(zhì)量(20±2) g(河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,合格證為:醫(yī)動字第04057號)。水迷宮購于上海新軟信息技術(shù)有限公司。蘇木素-伊紅(HE)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購于碧云天公司。Trizol試劑購于Aidlab公司。RNAspin Mini試劑盒購于GE Healthcare公司。BestarTMqPCR試劑盒購于DBI Bioscience公司。抗體購于Abcam公司。聚偏二氟乙烯膜購于EMD Millipore。化學(xué)發(fā)光法顯色試劑盒購于Thermo Fisher公司。顯微鏡購于Carl Zeiss公司。

1.2動物分組、建模和干預(yù) 參照Himori法制備VD小鼠模型〔7〕,通過腹腔注射1%戊巴比妥鈉(濃度為20 g/L,劑量為2 ml/kg)麻醉小鼠,麻醉完成后將小鼠仰臥固定,將頸部毛發(fā)剔除后切開暴露雙側(cè)頸動脈,利用栓線阻斷雙側(cè)頸總動脈10 min,然后再灌注24 h。通過水迷宮實驗檢測目標(biāo)象限停留時間<20 s且穿越平臺次數(shù)<4次為建模成功。將建模成功的120只小鼠隨機(jī)分為VD組,辣木葉低、中、高劑量組,每組30只。根據(jù)參考文獻(xiàn)〔8〕制備辣木葉提取液并灌胃,劑量分別為100、200、400 mg/kg,1次/d,連續(xù)28 d。另取30只健康BALB/c小鼠作為對照組,對照組僅暴露雙側(cè)頸動脈。對照組及VD組每日使用等體積雙蒸水灌胃。

1.3水迷宮實驗 用水注滿水迷宮,水迷宮溫度維持在(25±1)℃。平臺浸入水下1 cm。定位導(dǎo)航:各組置于水迷宮四象限,觀察90 s內(nèi)是否登上平臺。頻率為4次/d,每次間隔時間>2 min。探索:各組小鼠置于同一個象限中,觀察90 s內(nèi)靠墻運動軌跡,并記錄各組平臺停留時間、穿越平臺次數(shù)。

1.4HE染色 固定海馬神經(jīng)元組織,時間48 h,流水進(jìn)行沖洗。使用多濃度乙醇脫水,使海馬神經(jīng)元浸入石蠟中,切片,厚度為4～7 μm。脫蠟、水化、HE染色。蘇木素細(xì)胞核染色5 min,伊紅細(xì)胞質(zhì)染色1～2 min。光學(xué)顯微鏡(ECLIPSE Ni,Nikon USA)下觀察。

1.5ELISA ELISA檢測氧化應(yīng)激指標(biāo),包括血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛 (MDA)。研磨海馬組織4 ℃ 2 000 r/min離心20 min后取上清,抗體孵育2 h,加入顯色劑,時間10 min。450 nm下測定吸光度。

1.6RT-qPCR 提取總RNA,逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄為cDNA,qPCR實驗使用BestarTMqPCR預(yù)混液,RT-qPCR分析使用Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測系統(tǒng)。計算mRNA的相對表達(dá)量。

1.7Western印跡檢測蛋白 裂解海馬組織,離心,收集總蛋白,分離蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)膜,脫脂牛奶封閉2 h。一抗4 ℃孵育24 h,二抗室溫孵育1 h。顯影后計算灰度值。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理 每個檢測設(shè)立3個平行實驗,重復(fù)3次。采用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1辣木葉提取液對VD小鼠學(xué)習(xí)、記憶功能的影響 5組學(xué)習(xí)記憶能力比較差異顯著(P<0.05)。VD組目標(biāo)象限停留時間和穿越平臺次數(shù)顯著低于對照組(P<0.05);辣木葉低劑量組顯著高于VD組(P<0.05);辣木葉中劑量組顯著高于辣木葉低劑量組(P<0.05);辣木葉高劑量組顯著高于辣木葉中劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 各組水迷宮實驗結(jié)果及NF-κB通路蛋白表達(dá)比較

2.2辣木葉提取液對VD小鼠海馬組織損傷的影響 對照組海馬神經(jīng)元清晰,細(xì)胞核大而圓,位于細(xì)胞中央。VD組海馬神經(jīng)元表現(xiàn)為核凝聚、空泡化、炎癥細(xì)胞浸潤。辣木葉低劑量組核凝聚、空泡化情況較VD組有所減輕。辣木葉中劑量組核凝聚、空泡化情況顯著減少。辣木葉高劑量組海馬組織神經(jīng)元基本恢復(fù),僅有少量空泡化。見圖1。

圖1 HE染色檢測辣木葉提取液對VD小鼠海馬組織損傷的影響(小圖×400,大圖×200)

2.3辣木葉提取液對VD小鼠氧化應(yīng)激水平的影響 5組海馬組織中SOD和MDA水平差異顯著(P<0.05)。VD組較對照組SOD水平顯著降低,而MDA顯著升高(P<0.05)。辣木葉提取液干預(yù)后,3組SOD顯著升高,而MDA顯著降低(P<0.05),其中SOD水平辣木葉高劑量組>辣木葉中劑量組>辣木葉低劑量組;MDA水平辣木葉高劑量組<辣木葉中劑量組<辣木葉低劑量組(P<0.05)。見表2。

表2 各組氧化應(yīng)激水平mTOR和Cdc42水平

2.4辣木葉提取液對VD小鼠NF-κB通路的影響 5組NF-κB通路水平比較差異顯著(P<0.05)。VD組的IKK、NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05)。辣木葉低劑量組顯著低于VD組(P<0.05);辣木葉中劑量組顯著低于辣木葉低劑量組(P<0.05);辣木葉高劑量組顯著低于辣木葉中劑量組(P<0.05)。見表1、圖2。

1～5:對照組、VD組、辣木葉低、中、高劑量組

2.5辣木葉提取液對VD小鼠mTOR和Cdc42表達(dá)水平的影響 5組mTOR和Cdc42轉(zhuǎn)錄和翻譯水平比較差異顯著(P<0.05)。VD組的mTOR、Cdc42 mRNA和蛋白表達(dá)量顯著低于對照組(P<0.05)。辣木葉低劑量組顯著高于VD組(P<0.05);辣木葉中劑量組顯著高于辣木葉低劑量組(P<0.05);辣木葉高劑量組顯著高于辣木葉中劑量組(P<0.05)。見圖2、表2。

3 討 論

缺血-再灌注是誘發(fā)VD的主要原因之一,其發(fā)病率逐年攀升〔9〕。VD的發(fā)病機(jī)制涉及膽堿能系統(tǒng)、氧化自由基產(chǎn)生、一氧化氮、興奮性氨基酸等多方面損傷,且與認(rèn)知功能相關(guān)〔10〕。目前關(guān)于VD的治療主要通過改善腦循環(huán)和腦代謝、腦保護(hù)、 抗氧化及增強(qiáng)腦內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)功能來實現(xiàn),但臨床上尚無治療VD的特效藥物。

VD臨床表現(xiàn)包括認(rèn)知功能障礙、人格改變和記憶功能減退,VD還會增加腦卒中死亡率,延長恢復(fù)期,并增加經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)〔11〕。氧化應(yīng)激是VD的重要機(jī)制,研究顯示缺血-再灌注損傷、高齡、吸煙、血壓異常等是VD的主要誘因,而這些損傷均會造成腦組織中氧化-抗氧化失衡,引起SOD降低和MDA升高〔12〕。而氧化應(yīng)激反應(yīng)不但會促進(jìn)炎性反應(yīng)損害海馬神經(jīng)元,還會導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡,從而引起神經(jīng)功能障礙〔13〕。文獻(xiàn)證明,辣木具有抗氧化、提高記憶力、促進(jìn)神經(jīng)元存活等作用,在辣木的不同部位中,葉的抗氧化活性最強(qiáng),研究顯示,辣木葉可通過抗氧化調(diào)控細(xì)胞的存活和凋亡〔14〕。Adebayo等〔15〕研究結(jié)果顯示,辣木葉的生物氧化鋅納米粒子通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和乙酰膽堿酯酶活性消除魚藤酮誘導(dǎo)的神經(jīng)內(nèi)分泌毒性。動物研究結(jié)果顯示,長期食用辣木葉補(bǔ)充飲食可促進(jìn)抗氧化能力、增強(qiáng)大鼠海馬的神經(jīng)認(rèn)知并保護(hù)神經(jīng)功能〔16〕,本研究結(jié)果提示,辣木葉提取液能夠改善VD小鼠神經(jīng)功能,促進(jìn)海馬組織中SOD水平并抑制MDA水平,且隨著辣木葉提取液干預(yù)劑量的升高,保護(hù)作用更顯著。本研究結(jié)果說明,辣木葉提取液能夠顯著改善VD小鼠學(xué)習(xí)記憶功能,且抑制海馬組織中氧化應(yīng)激水平。

NF-κB通路與氧化應(yīng)激和神經(jīng)元損傷密切相關(guān),一方面NF-κB會調(diào)控mTOR表達(dá),進(jìn)而調(diào)控下游SOD、MDA水平,從而調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激〔17,18〕;另一方面,氧化應(yīng)激會激活I(lǐng)KK和NF-κB促進(jìn)炎性損傷和神經(jīng)元凋亡,引起海馬體受損〔19〕。mTOR作為信號通路的效應(yīng)分子,其通過活化后介導(dǎo)下游信號通路,調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和增殖〔20〕。Cdc42是質(zhì)膜相關(guān)小GTP酶,調(diào)控活性GTP結(jié)合狀態(tài)和非活性GDP結(jié)合狀態(tài)之間循環(huán),在活躍狀態(tài)下與多種效應(yīng)蛋白結(jié)合以調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng),研究顯示其是反映海馬體功能的關(guān)鍵蛋白,Cdc42降低提示海馬神經(jīng)元功能受損〔21〕。本研究結(jié)果顯示,VD小鼠海馬神經(jīng)元中NF-κB通路升高,而mTOR、Cdc42水平降低,而辣木葉提取液能夠抑制IKK、NF-κB轉(zhuǎn)錄和翻譯,促進(jìn)mTOR、Cdc42 mRNA和蛋白的表達(dá),且高劑量辣木葉提取液的干預(yù)作用更顯著。Abdel-Daim等〔22〕研究表明,辣木葉提取物會通過 NF-κB 信號通路緩解鈷介導(dǎo)的氧化損傷和炎癥保護(hù)大鼠腎臟組織。本研究結(jié)果提示,辣木葉提取液能夠調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng),抑制NF-κB通路,促進(jìn)mTOR和Cdc42蛋白表達(dá),從而促進(jìn)海馬神經(jīng)元存活并幫助維持神經(jīng)元功能,從而緩解VD。

綜上,辣木葉可能通過調(diào)控VD小鼠氧化應(yīng)激狀態(tài),抑制NF-κB通路,引起海馬中mTOR、Cdc42表達(dá)增加,進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡數(shù),保護(hù)受損神經(jīng)元細(xì)胞,從而改善學(xué)習(xí)記憶功能。然而,本研究結(jié)果初步得到辣木葉能夠保護(hù)VD小鼠神經(jīng)功能的機(jī)制可能與NF-κB通路有關(guān),仍需體內(nèi)或體外驗證實驗,此外,辣木葉提取液緩解VD的作用和安全性仍需臨床研究。