溫潤通脈方調控氧化應激水平對充血性心力衰竭大鼠心肌的保護作用

賈運時 劉琪 馬秀娟 宋溫婷 付玉娜 陳華

(1石家莊市中醫院心病二科,河北 石家莊 050051;2河北省人民醫院)

充血性心力衰竭是由遺傳、能量代謝等多種因素共同參與,導致心臟泵血功能降低、血液運行遲滯的一種臨床多發疾病。主要特征為心排血量降低及血液灌流減少等,故又稱心功能不全〔1,2〕。該病具有高發病率、高致殘率及高死亡率,且隨著年齡的增加,患病風險也隨之上升,這對患者的生命健康造成了極大威脅,因此探尋一種有效的防治手段已成為醫學界重點關注的課題之一〔3,4〕。充血性心力衰竭的病因復雜,目前尚不完全明確,目前已知的主要有心肌重塑、微循環障礙、趨化因子及神經內分泌激活和心肌細胞凋亡等幾個方面〔5〕。研究表明,氧化應激在心血管系統結構和功能異常中發揮重要作用,其產生的過量氧自由基會對心肌細胞膜造成損傷,從而促進心室重構并造成心肌能量代謝缺陷,最終加重心肌損傷,因此抑制氧化應激反應理論上可延緩心力衰竭病情的發展〔6〕。目前,臨床上治療充血性心力衰竭多為西藥治療,但效果并不理想,存在副作用大、長期預后效果欠佳等問題,而中醫作為我國傳統醫學,其具有完整的理論體系,且安全性高,在心力衰竭方面具有廣闊的發展前景〔7,8〕。溫潤通脈方是由炒白芍、桂枝、茯苓及炙甘草四藥配伍的傳統中藥方劑,其具有補益心陽、調和營血、溫通血脈、化陰養血,溫潤通脈之效〔9〕。而心力衰竭正是心陽不足、虛衰而竭、血行不暢等原因所致,但目前臨床有關其對心力衰竭的研究幾近于無,因此本文就溫潤通脈方調控氧化應激水平對充血性心力衰竭大鼠心肌保護作用進行研究探討,為臨床治療缺血性心力衰竭提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1實驗動物 北京億鳴復興生物科技有限公司提供的60只SPF級SD大鼠〔合格證書為:SCXK(京)2018-0006〕,體質量250～300 g,單籠喂養,室溫生長,無菌自由進食、進水2 w,按照《實驗動物管理條例》規定進行實驗。

1.2試劑與儀器 參芪益心湯、溫潤通脈湯均由醫院煎劑室提供。硫辛酸(批號:SND-1705)購自滁州仕諾達生物科技有限公司。生物機能實驗系統、大小鼠便攜式彩色多普勒超聲成像儀(型號:MyLab)均購自上海玉研科學儀器有限公司。德國Eppendorf公司高速冷凍離心機(型號:5024R)。日本OLYMPUS公司光學顯微鏡(型號:CX-60)。德國Leica公司自動包埋機(型號:EG1150)。Sigma-AldrichLLC.公司多聚甲醛(批號:158127)。上海一研生物科技有限公司蘇木素染液(批號:EY-19374)。上海吉至生化科技有限公司伊紅染液(批號:AG1100-100 ml)。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(批號:446502)購自美國R&D公司。南京德鐵實驗設備有限公司全波長酶標儀(批號:HBS-ScanX)。放射免疫沉淀測定(RIPA)裂解液(批號:SY4680)、生理鹽水(YT3740)均購自北京伊塔生物科技有限公司。江蘇凱基生物科技發展有限公司的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒、電化學發光(ECL)檢測試劑盒(批號:KGP113、KGP1123)。超氧化物歧化酶(SOD)抗體(批號:PL0402056)購自深圳豪地華拓生物科技有限公司。丙二醛(MDA)抗體(批號:PAB14355)購自上海群己生物科技有限公司。GAPDH抗體(批號:10094-MM09-50)購自北京義翹神州科技股份有限公司。

1.3模型制備與分組 選取40只SPF級SD雄性大鼠,隨機分為正常(N)組,模型(M)組,參芪益心方(S)組,溫潤通脈方(W)組,每組10只。M、S、W組進行充血性心力衰竭建模大鼠給予腹腔注射鹽酸阿霉素,共注射6 w,單周注射劑量為3 mg/kg,雙周注射劑量為2 mg/kg,每周注射1次,注射完成后,用彩超測定計算出左心指數,當左心指數≤180 ml/(min·kg)時視為建模成功,N組建模,同期給予同體積生理鹽水。建模成功后,S組灌胃參芪益心湯20 g/kg,W組灌胃溫潤通脈湯6 g/kg,1次/d,N組、M組同期灌胃同體積生理鹽水,持續28 d。

1.4血流動力學測定 給藥完成后用生物機能實驗系統測量各組大鼠心率(HR)、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末期壓(LVEDP)等血流動力學參數。

1.5心肌功能測定 由電檢科醫生為各組大鼠做彩色超聲多普勒心動圖,測定左室收縮末期內徑(LVSD)、左室舒張末期內徑(LVDD)、室間隔(IVS)、左心室勞損(LVS)、左室射血分數(LVEF),各項數值均經計算機處理后獲得。

1.6標本采集 大鼠眼球取血5 ml,將其放入冷水浴冷卻的酶抑制抗凝管中,搖勻后冷藏2 h,2 500 r/min離心7 min,棄掉上清液,得血漿樣品放入冰箱密封保存,同時取心肌組織,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后,用4%的多聚甲醛固定96 h,洗滌后在冰箱中密封保存。

1.7心肌組織病理檢測 心肌組織常規石蠟包埋、切片,二甲苯脫蠟、梯度乙醇復水后蘇木素-伊紅(HE)染色,除去多余染液后,用梯度乙醇脫水、二甲苯透明,中性樹膠封片處理后光學顯微鏡進行組織病理學觀察。

1.8血漿SOD、MDA水平測定 采用ELISA檢測,嚴格按照試劑盒說明操作,配制標準品,然后進行溫育30 min、洗滌5次、加酶、再溫育30 min、洗滌5次處理,拍干后在37 ℃下避光顯色15 min,加入終止液終止反應,立即在450 nm波長處測定每孔吸光度,繪制標準曲線,根據SOD、MDA吸光度計算SOD、MDA水平。

1.9心肌組織中SOD、MDA蛋白表達檢測 另取20只大鼠,建模后隨機分為兩組,一組給予灌胃60 mg/kg氧化應激抑制劑硫辛酸,記為O組,一組給予硫辛酸聯合溫潤通脈湯,記為T組,免疫印跡法檢測N、M、S、W、O、T組心肌組織中SOD、MDA蛋白,取心肌組織,清洗、剪碎后置于離心管中,加入RIPA裂解液,于冰上充分裂解10 min,10 000 r/min離心10 min,取上清液用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度用SDS-PAGE試劑盒進行電泳,其步驟為濃縮膠80 V 30 min,分離膠120 V 1 h,將凝膠上蛋白用半干法轉移至甲醇活化的聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,120 V轉膜1.5 h,在7 ℃、5%BSA 條件下封閉2 h;按說明書用封閉液稀釋一抗(1∶1 000),加入稀釋的SOD、MDA一抗,4 ℃搖床振蕩孵育過夜后洗膜;加入稀釋的二抗( 1∶5 000),37 ℃輕搖室溫孵育2 h;洗膜后,用電化學發光熒光試劑盒測定,以同一樣本中的GAPDH作為內參,計算比值求得SOD、MDA蛋白的相對表達含量。

1.10統計學分析 采用GraphPad Prism8.0進行t檢驗、χ2檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組血流動力學結果 與N組相比,M組HR、SBP、DBP、LVSP、LVEDP均顯著升高(P<0.05);與M組比較,S、W組HR、SBP、DBP、LVSP、LVEDP均顯著降低(P<0.05),且W組比S組降低顯著(P<0.05),見表1。

表1 各組血流動力學指標及血漿SOD、MDA水平比較

2.2各組血漿中SOD、MDA水平 與N組相比,M組血漿中SOD水平顯著降低(P<0.05),MDA水平顯著升高(P<0.05)。S、W組血漿中SOD水平較M組顯著升高(P<0.05),MDA水平顯著降低(P<0.05),W組比S組變化顯著(P<0.05),見表1。

2.3各組心肌功能相關指標結果 與N組相比,M組LVSD、LVDD、IVS、LVS均顯著升高(P<0.05),LVEF顯著降低(P<0.05);與M組比較,S、W組LVSD、LVDD、IVS、LVS均顯著降低(P<0.05),LVEF顯著升高(P<0.05),且W組變化比S組顯著(P<0.05),見表2。

表2 各組心肌功能相關指標比較

2.4各組心肌組織HE染色結果 N組心肌組織結構正常且排列整齊,細胞質紋理清晰,細胞核大小、形態基本一致,且未見間質細胞增生及明顯壞死、萎縮等現象,而M組心肌組織結構明顯松弛,心肌出現肌漿凝聚、核固縮,且有不同程度的顆粒及空泡變性,可見間質面積明顯增大及出血,與M組相比,S、W兩組癥狀明顯改善,心肌組織結構趨向完整,且W組比S組改善明顯,見圖1。

圖1 各組心肌組織(HE染色,×400)

2.5各組心肌組織中SOD、MDA蛋白表達 與N組相比,M組心肌組織中SOD蛋白表達顯著降低(P<0.05),MDA蛋白表達顯著升高(P<0.05);與M組比較,S、W組心肌組織中SOD蛋白表達顯著升高(P<0.05),MDA蛋白表達顯著降低(P<0.05),且W組變化比S組顯著(P<0.05),而O組與W組相比無明顯差異(P>0.05),T組比O組變化明顯(P<0.05),見表3、圖2。

圖2 各組心肌組織中SOD、MDA蛋白表達

表3 各組心肌組織SOD、MDA蛋白表達比較

3 討 論

本文結果說明,溫潤通脈方可顯著改善充血性心力衰竭大鼠血流動力學。參芪益心方是經臨床多年驗證的有效治療心力衰竭的中藥方,該方緊扣心力衰竭的病因、病機,加入了人參、黃芪等具有保護心肌作用的中藥,在活血利水、益氣溫陽等方面發揮重要作用〔10〕。而溫潤通脈方中炒白芍養血斂陰、柔肝止痛,桂枝能通經脈、助心陽、止悸動,茯苓可寧心安神、益心脾,炙甘草可益氣復脈、補益心脾,此四方配伍正合仲景“病痰飲者,當以溫藥和之”之意〔11〕。現代研究表明,心力衰竭的基本發病機制是血流動力超負荷,導致機體內微循環出現紊亂,從而引起血管內皮功能受到損傷,進而加重局部臟器功能損傷,最終導致衰竭的出現〔12〕。而溫潤通脈方可能是通過降低心肌的自律性,抑制交感神經興奮,來提高心臟做功效率,增加心排血量及心肌供氧,從而抑制神經體液細胞因子激活、抑制血管收縮、抑制醛固酮的分泌,進而降低HR及血壓,有效緩解和逆轉心肌重構情況,最終達到改善血流動力學的目的。董肖等〔13〕研究發現,益氣通脈湯對慢性心力衰竭有顯著療效,可有效改善血流動力學指標,提高心臟供血能力,這與本文結果類似。

本研究表明,溫潤通脈方具有顯著療效,其可有效改善充血性心力衰竭大鼠的心肌功能,并對其起到一定保護作用。本文選擇超聲心動圖來評價大鼠的心肌功能,是因為其在心臟影像學中居主導地位,是評價心臟結構及功能的重要手段,也是評估心力衰竭的唯一最有用的檢查工具〔14〕。心力衰竭最主要的特征就是心室功能障礙及神經體液調改變,最終導致心肌功能受損,生存時間明顯縮短,而心力衰竭并不能根治,只能通過藥物治療來達到緩解癥狀或維持現狀的目的〔15〕。對于充血性心力衰竭大鼠,溫潤通脈方可能是通過擴冠、增加心肌灌流,來改善心肌舒張及收縮功能、增加心肺壓力感受器敏感性,從而降低外周血管阻力、改善毛細血管的血液循環、降低心臟后負荷,進而降低心肌耗氧、抑制血小板聚集、降低心臟做功,最終抑制心室重構,改善大鼠疾病癥狀。研究發現〔16〕,養心通脈湯可顯著改善患者心功能,并對其心肌起到一定保護作用,這與本文結果類似。

本研究說明,溫潤通脈方可顯著抑制氧化應激。氧化應激是體內抗氧化與氧化作用失衡的一種狀態,被認為是導致疾病和衰老的一個重要因素,而SOD及MDA是反映氧化應激狀態的重要指標〔17〕。SOD被視為生命科技中最具神奇魔力的酶,是機體內氧自由基的頭號殺手,可保護細胞免受自由基攻擊,而MDA是細胞膜被氧化后形成的脂質過氧化物,其水平可以用來評估體內氧化應激程度和脂質過氧化損傷程度,在機體內脂質過氧化損傷中扮演重要角色〔18〕。心室重構是心力衰竭發生的核心基礎,氧化應激損傷心肌細胞膜,從而改變離子通道,加重心肌纖維化及心肌細胞損傷,促進心室重構〔19〕。而對于充血性心力衰竭大鼠,溫潤通脈方可能是通過改善心肌收縮功能及心肌興奮,來抑制鈣離子的轉運,并改善細胞膜的流動性及通透性,從而有效清除氧自由基、抑制細胞膜脂質過氧化、抑制部分蛋白酶的活性,進而抑制氧化應激水平,抑制心肌纖維化及心室重構,最終有效制止心力衰竭進一步惡。王從陽等〔20〕研究發現,溫潤通脈方可顯著提高SOD活力,降低MDA水平,這說明其可顯著抑制氧化應激水平,這與本文結果類似。

綜上所述,溫潤通脈方對充血性心力衰竭大鼠具有顯著療效,可對心肌起到一定保護作用,其作用機制可能是通過抑制氧化應激來實現的。