消飲化瘀方調節P38MAPK表達治療慢性心力衰竭大鼠心肌纖維化

王銘 王秀萍 徐建虎

(寧夏醫科大學中醫學院,寧夏 銀川 750004)

慢性心力衰竭(CHF)是指心臟收縮和舒張功能發生障礙,使體循環或肺循環瘀血,從而出現心動過速、呼吸困難、下肢水腫為主要表現的一組臨床綜合征〔1〕,是所有心臟疾病自然病程的最終歸宿,具有難以治愈且不可逆的特點,成為嚴重危害患者健康的疑難病癥。心肌彌漫性纖維化是CHF的常見病理學改變,是心室重構的主要原因〔2〕。心肌纖維化主要是由于細胞外基質(ECM)的過量形成和沉淀,從而產生了瘢痕組織,進而引起的心肌內部結構改變,導致心肌順應性降低、心臟舒縮功能受損,長期的容積或壓力過負荷最終可引起心力衰竭〔3〕。因此,改善心肌纖維化在防治CHF中起到極為重要的作用〔4,5〕。研究發現P38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)可以抑制ECM中膠原沉積,在改善心肌纖維化中起著重要作用〔6〕。中醫認為CHF早、中期應以瘀血立論,以扶正化瘀施治。課題組通過整理文獻及實驗研究均發現,單純從瘀血立論并不完全符合早期CHF的病機,水飲病邪在其中發揮重要作用。前期研究結果表明,溫陽消飲法可降低CHF大鼠血管緊張素(Ang)Ⅱ、腫瘤壞死因子(TNF)-α及白細胞介素(IL)-6,抑制炎癥反應〔7〕;可升高CHF大鼠降鈣素基因相關肽(CGRP),降低內皮素(ET),調節心臟舒縮功能〔8〕;可通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)信號通路抑制心肌細胞凋亡,防止心肌受損〔9〕,提示早期CHF“從飲論治”的科學性。同時選用血府逐瘀膠囊作為對照組藥物,二組藥物療效相當,說明水飲和瘀血在CHF早期均發揮了重要致病作用。因此,在CHF早期單純從瘀論治或從飲論治均是不全面的。所以本課題將“飲瘀致病”作為治療的切入點,認為CHF早期應消飲化瘀,并通過消飲化瘀方干預CHF大鼠,揭示其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1動物 6～8周齡雄性SD大鼠,SPF級,體質量240～260 g,由寧夏醫科大學動物中心提供〔許可證號:SCXK(京)2019-0008〕。

1.2藥物及試劑 消飲化瘀方中藥材均購自寧夏醫科大學附屬回醫中醫院門診部,經寧夏醫科大學藥學院中藥教研室檢驗合格;美托洛爾(阿斯利康藥業有限公司,批號:H32025391);鹽酸阿霉素(源葉生物公司,批號:S17092)。蘇木素染液(北京百靈威科技有限公司);伊紅染液(源葉生物,R20594);羥脯氨酸(Hyp)、Ⅰ型膠原(ColⅠ)及Ⅲ型膠原(ColⅢ)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均購自上海信裕生物科技有限公司;P38MAPK抗體(BIOSS,BS0637R);β-actin抗體(Affinity,AF7018);山羊抗鼠的二抗(北京中杉,ZB2305ECL);電化學發光(ECL)試劑盒(中杉金橋公司,貨號sc-2048);HiFiScriptT 快速去除基因組cDNA第一條鏈合成試劑盒(康為試劑,Cat# CW2582M);2*SYBR Mixture 熒光定量試劑盒(北京天根,Cat# FP-205-2)。

1.3實驗儀器 切片機(上海徠卡儀器有限公司,RM2016);電泳儀(北京六一公司,DYCZ-24DN);掃描儀(EPSON 公司,V19);熒光定量PCR儀(美國Bio-RAD,CFX ConnectTM);核酸蛋白定量儀(美國丹諾爾,DS-11)。

1.4動物分組及造模方法 用計算機隨機數字法將72只SD雄性大鼠分為空白組與A組,A組參考文獻〔10〕采用腹腔注射2 mg/kg鹽酸阿霉素復制CHF模型,每周2次,共12次。造模成功后將CHF大鼠隨機分為模型組、消飲化瘀方高、中、低劑量(中藥高、中、低)組、美托洛爾組,各12只。

1.5藥物干預 根據《中國藥典》藥物制備的相關要求,將消飲化瘀方濃縮至含生藥2 g/ml的藥液,給藥劑量按照成人與大鼠體表面積折算,分別給予消飲化瘀方高(28 g/kg)、中(14 g/kg)、低(7 g/kg)及美托洛爾(10 mg/kg)灌胃,空白組和模型組給予等量的生理鹽水,每日1次,連續4 w。

1.6蘇木素-伊紅(HE)染色觀察心肌組織形態學變化 取心肌組織放入4%多聚甲醛固定,經沖水、梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟后,制成切片,烘片60 ℃ 2 h后進行脫蠟、梯度酒精脫水、蘇木素染色、鹽酸酒精分化、伊紅染色、透明、封片。顯微鏡下觀察心肌組織形態學變化并拍照。

1.7ELISA檢測心肌組織中Hyp、ColⅠ、ColⅢ含量 用組織勻漿機將心肌組織勻漿,取上清。按照ELISA試劑盒說明書分別設定標準品孔,空白孔及待測樣品孔。標準品孔加入不同梯度的標準品,待測樣品孔按照分組依次加入上清液及樣品稀釋液,空白孔不加。37 ℃孵育30 min;洗滌5次。除空白孔外,其余孔均加酶標試劑。37 ℃孵育30 min,洗滌5次。加顯色液A、B,37 ℃避光顯色15 min,加終止液。用酶標儀測定測量各孔的吸光度(OD)值,最后將OD值代入標準品的多項式二次回歸方程,確定最終濃度。

1.8Western印跡檢測心肌組織P38MAPK蛋白表達 將心肌組織加入RIPA裂解液,研磨,離心10 min,取上清,測定蛋白濃度。根據蛋白定量的結果,加入相應體積的總蛋白樣品與4×上樣緩沖液,95 ℃變性10 min,室溫平衡。將樣品加入配好的凝膠孔中,50 V進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),后濕轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂奶粉封閉2 h,分別在孵育盒中孵育一抗P38MAPK(1∶800),4 ℃反應過夜,用1×PBST洗滌3次,每次10 min。孵育二抗,常溫90 min,用1×PBST洗滌3次,每次10 min。ECL試劑盒曝光膠片,將膠片掃描后,用ImageJ軟件測定條帶灰度值。以β-actin為內參。

1.9實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測心肌組織中P38MAPK mRNA表達水平 用Trizol提取心肌組織中總RNA,然后將其逆轉錄為cDNA,并進行實時熒光定量PCR檢測。引物序列(5′-3′):P38MAPK(106 bp):上游:CTCGGTGTGTGCTGCTT TTGAT,下游:CTCCCTGTAGGTCCTTTTGGCG;β-actin(93 bp):上游:CTGAGAGGGAAATCGTGCGTGA,下游:AGGAAGAGGATGCGGCAGTGGC。預變形95 ℃,15 min后,95 ℃變性10 s、退火30 s、72 ℃延伸30 s,40個循環。采用2-△△Ct法進行數據的相對定量分析。

1.10統計學分析 采用SPSS26.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t法。

2 結 果

2.1消飲化瘀方對大鼠心肌組織形態學變化的影響 HE染色結果顯示:空白組可見心肌細胞橫紋清楚,排列整齊,無肌纖維斷裂,胞質均勻,表明心肌為正常結構;模型組可見心肌細胞排列紊亂,心肌間質水腫,肌纖維斷裂,伴有大量的慢性炎癥細胞浸潤,出現明顯的心肌纖維化特征;各治療組與模型組相比,心肌細胞排列變整齊,無心肌纖維斷裂。見圖1。

圖1 各組心肌組織形態學(HE染色,×200)

2.2消飲化瘀方對心肌組織Hyp、ColⅠ、ColⅢ含量的影響 與空白組相比,模型組Hyp、ColⅠ、ColⅢ含量均明顯升高(P<0.01);與模型組相比,各治療組Hyp、ColⅠ、ColⅢ含量均有所下降,其中除中藥低、中劑量組Hyp,中藥低劑量組ColⅢ療效不明顯外,其他各指標均明顯下降(P<0.05,P<0.01)。見表1。

表1 各組Hyp、ColⅠ、ColⅢ型含量 mRNA和蛋白表達比較

2.3消飲化瘀方對心肌組織P38MAPK蛋白及mRNA表達水平的影響 與空白組相比,模型組P38MAPK蛋白及mRNA含量明顯升高(P<0.01);與模型組相比,各治療組P38MAPK蛋白及mRNA含量明顯降低(P<0.05,P<0.01)。見表1、圖2。

1～6:空白組、模型組、美托洛爾組、中藥低、中、高劑量組

3 討 論

中醫將CHF歸屬于“心悸”“喘證”“水腫”“支飲”“心水”的范疇,認為心陽不足,鼓血無力,導致瘀血水飲內停是其發病機制。2014年《慢性心力衰竭中醫診療專家共識》也指出了痰飲和瘀血在CHF中的重要性,提出活血化痰利水的治法〔11〕。消飲化瘀方是根據《金匱要略》“病痰飲者,當以溫藥和之”的治療原則,選用苓桂術甘湯合葶藶大棗瀉肺湯為主方,加丹參、川芎、葛根組成。丹參、川芎、葛根經現代藥理學研究具有抗炎〔12〕、抗纖維化〔13〕、保護心臟〔14〕等作用,是治療心血管病的常用藥對。方中桂枝、甘草相伍,還具有溫補心陽的作用;丹參除活血之功外,尚有補血之力。故消飲化瘀方溫陽補血,消飲化瘀,標本兼治,重在治標,契合CHF早期病機。

心肌纖維化的主要特征是ECM的過度沉積〔15〕。ColⅠ和ColⅢ是構成ECM的主要結構蛋白。ColⅠ約占心肌膠原總量的85%,負責建立厚纖維,賦予其抗拉伸強度。ColⅢ占正常心臟膠原蛋白總蛋白的11%,以細纖維的形式聚集,負責基質網絡的彈性〔10〕。當心臟受到病理因素刺激時會生成大量的ColⅠ和ColⅢ,形成ECM,ECM過度沉積會導致心肌間質增生,炎性細胞浸潤,肌纖維排列紊亂、斷裂,導致間質纖維化,從而引起心臟舒縮功能障礙〔16〕。心臟組織中Hyp含量代表大鼠心臟中膠原總量,反映了心肌纖維化的程度〔17〕。本研究說明,CHF大鼠心臟受到了刺激釋放出大量ColⅠ、ColⅢ,合成ECM,導致心肌中膠原含量過高;消飲化瘀方可以減輕病理因素對CHF大鼠心臟的刺激,減少ColⅠ、ColⅢ的分泌,使ECM的合成降低,平衡心肌中膠原蛋白的含量,改善CHF大鼠心肌纖維化,但與消飲化瘀方的劑量存在一定的效應關系。

MAPK信號通路是參與心肌細胞炎癥、凋亡及間質纖維化的匯聚點〔4〕。P38MAPK作為MAPK的主要亞族,參與了心肌纖維化的全過程。P38MAPK可通過影響膠原蛋白的合成及心肌纖維化細胞的分化調控心肌纖維化的發生、發展〔18〕。相關研究表明,使用P38抑制劑(SB203580)可明顯改善缺血再灌注導致的心肌損傷〔19〕,減少心肌梗死大鼠的心肌膠原含量〔20〕。羅麗芳等〔21〕研究發現,桃葉珊瑚苷可通過抑制P38MAPK通路來調控心肌成纖維細胞的增殖和ECM的生成。肖海等〔22〕研究發現,氧化苦參堿可通過抑制P38MAPK磷酸化,從而抑制TGF-β1誘導心肌成纖維細胞增殖的作用及相關膠原蛋白的表達,改善心肌纖維化。因此P38MAPK可作為治療CHF心肌纖維化的靶點之一。本研究結果說明,消飲化瘀方可以通過抑制P38MAPK的表達,從而影響ColⅠ、ColⅢ及HYP的合成,改善CHF大鼠心肌纖維化。

同時,本實驗選用腹腔注射阿霉素為造模方法,后期易導致CHF大鼠出現不同程度的心包積液或胸腔積液,符合本次研究“水飲致病”的特點。其次CHF大鼠心臟泵血功能障礙導致體循環或肺循環瘀血,符合本次研究“瘀血致病”的特點。但缺點是未對“飲瘀致病”做一個量化標準,將在后續的研究中進行完善。

綜上,消飲化瘀方對CHF大鼠防治作用機制可能與抑制P38MAPK的表達,減少心肌膠原蛋白的合成,改善心肌纖維化有關。