氯沙坦通過IRE1-TRAF2-ASK1-JNK信號通路調節高糖誘導的血管平滑肌細胞的增殖、凋亡和遷移

于文會 張巖 臧亞茹 段書眾

(承德醫學院附屬醫院 1藥學部,河北 承德 067000;2腎臟內科)

心血管疾病是糖尿病患者死亡和發病的主要原因,尤其是動脈粥樣硬化,因糖尿病患者的血管平滑肌細胞(VSMCs)受損而引發〔1〕。高血糖可促進VSMCs增殖和遷移并抑制其凋亡,導致VSMCs在血管內膜中積累,引起動脈粥樣硬化斑塊在血管內壁的沉積,并誘導內膜增厚、血管重塑〔2〕。因此防止高糖誘導的VSMCs遷移、增殖并提高凋亡,可能是糖尿病性血管病有希望的治療方案。氯沙坦(LT)是一種血管緊張素受體阻滯劑,除了降低血壓外,它還具有多種公認的治療效果如抗炎、抗纖維化等〔3〕。研究發現LT可以抑制VSMCs中血管緊張素Ⅱ誘導的細胞增殖〔4〕,但能否改善VSMCs受損尚不可知。研究發現內質網應激信號通路參與調控VSMCs表型轉化、轉分化、凋亡,從而參與動脈粥樣硬化、高血壓、動脈瘤及血管鈣化形成〔5〕,因此內質網應激機制被認為是治療血管性疾病的靶點,而肌醇需求酶(IRE)1-腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAF)2-凋亡信號調節激酶(ASK)1-c-Jun N末端激酶(JNK)信號通路是內質網應激發揮作用的主要信號通路〔6〕。本研究旨在探討LT能否通過IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路調節高糖誘導的VSMCs增殖、凋亡和遷移。

1 材料與方法

1.1動物來源 廣州中醫藥大學提供雄性、清潔級Sprague-Dawley大鼠,5周齡,體質量118～125 g,動物許可證號:SCXK(粵)2019-0047。所有程序按照醫院動物護理和使用委員會制定的指南進行,且該指南符合ARRIVE動物研究指南。

1.2主要材料、儀器 LT(武漢浩榮生物科技有限公司);細胞計數試劑盒(CCK)-8(北京索萊寶科技有限公司);Transwell小室(Corning公司);IRE1α激動劑-毒胡蘿卜素(TG,Santa Cruz公司);膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(AnnexinV-FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑盒(欣博盛生物科技有限公司);Abcam公司提供IRE1、TRAF2、磷酸化(p)-ASK1、ASK1、p-JNK、JNK一抗。FACS Calibur流式細胞儀(BD公司);熒光顯微鏡(Olympus公司);BIO-RAD 680型全自動酶標儀(美國伯樂公司)。

1.3細胞分離及鑒定 首先將戊巴比妥鈉麻醉大鼠,然后脫頸處死大鼠,分離出整個胸主動脈,之后縱向切開胸主動脈,用無菌彎頭鑷子去除內皮細胞,小心剝離血管外膜,將主動脈組織切成1 mm3小塊,加入膠原酶在37 ℃、5%CO2培養箱中消化主動脈組織,之后細胞利用胰蛋白酶消化并進行常規培養,并通過α-平滑肌動蛋白(SMA)抗體免疫熒光鑒定VSMCs,用于后續實驗。

1.4細胞分組 取對數生長期VSMCs,并分組為:空白組、高糖組,同時在高糖組的基礎上設置高糖+LT組、高糖+TG組、高糖+LT+TG組。其中空白組未經任何處理;高糖組采用25 mmol/L葡萄糖處理〔7〕;高糖+TG組采用25 mmol/L葡萄糖處理前0.5 h先加入0.2 nmol/L IRE1α激動劑-TG處理〔8〕;高糖+LT組采用25 mmol/L葡萄糖處理前0.5 h先加入10 μmol/L LT處理〔9〕;高糖+LT+TG組采用25 mmol/L葡萄糖處理前0.5 h先加入10 μmol/L LT、0.2 nmol/L TG處理。

1.5CCK-8法檢測細胞增殖 以5×103個細胞/孔的密度接種VSMCs并在96孔板中培養,分別孵育48 h以刺激細胞增殖。隨后加入10 μl CCK-8試劑,將細胞在37 ℃下進一步孵育2 h,測量每組樣品在450 nm波長處的光密度(OD)值評估細胞增殖。

1.6流式細胞術檢測細胞凋亡 將各組細胞經胰蛋白酶消化后離心,洗滌細胞兩次,然后重新懸浮在500 μl結合緩沖液中,在室溫下于黑暗中加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和5 μl PI溶液,染色15 min,通過流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。

1.7劃痕實驗檢測細胞遷移率 VSMCs(1.5×105/孔)接種在6孔板中,然后使用200 μl無菌移液器吸頭進行刮擦,磷酸鹽緩沖液(PBS)用于去除損傷的細胞,該時間點設置為0 h。各組VSMCs連續培養24 h。在0 h和24 h拍攝每個樣品照片,用ImageJ測量0、24 h的劃痕寬度評估VSMCs遷移率;遷移率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.8Transwell實驗檢測細胞遷移 將預處理的各組細胞(1×105/孔)接種到無血清DMEM的上室中,下室補充有20%胎牛血清(FBS)的DMEM。孵育12 h后,遷移到下室的VSMCs用4%甲醛固定20 min,結晶紫染色。然后隨機選取5個視野,在200倍光鏡下對細胞進行計數。

1.9Western印跡檢測IRE1-TRAF2-ASK1-JNK相關蛋白表達水平 收集所有細胞,用緩沖液于冰上裂解,然后測定總蛋白濃度,用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)從每個樣品中分離10 μg總蛋白,之后轉膜、封閉,將蛋白質轉移到膜上并與IRE1、TRAF2、p-ASK1、ASK1、p-JNK、JNK、β-actin一抗孵育過夜。然后使用二抗孵育并使其可視化,ImageJ軟件分析蛋白表達水平。

1.10統計分析 采用SPSS26.0軟件進行方差分析,兩兩比較行SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1VSMCs鑒定 通過VSMCs特異性標志物-α-SMA染色進行鑒定,胞質內可見大量熒光,α-SMA抗體呈陽性,見圖1。

圖1 VSMCs鑒定(×200)

2.2LT對各組VSMCs增殖的影響 各組VSMCs增殖率比較:高糖組較空白組、高糖+TG組較高糖組、高糖+LT+TG組較高糖+LT組均明顯升高(P<0.05);高糖+LT組較高糖組、高糖+LT+TG組較高糖+TG組均明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組細胞增殖、凋亡率、遷移率、遷移、IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路蛋白表達的影響

2.3LT對各組細胞凋亡的影響 各組細胞凋亡率比較:高糖+LT+TG組較高糖+LT組明顯降低(P<0.05);高糖+LT組較高糖組、高糖+LT+TG組較高糖+TG組均明顯升高(P<0.05)。見表1、圖2。

圖2 各組細胞凋亡變化

2.4LT對各組細胞遷移率的影響 各組細胞遷移率比較:高糖組較空白組、高糖+TG組較高糖組、高糖+LT+TG組較高糖+LT組均明顯升高(P<0.05);高糖+LT組較高糖組、高糖+LT+TG組較高糖+TG組均明顯降低(P<0.05)。見表1、圖3。

圖3 劃痕實驗檢測各組細胞遷移(×100)

2.5LT對各組細胞遷移數目的影響 各組細胞遷移數比較:高糖組較空白組、高糖+TG組較高糖組、高糖+LT+TG組較高糖+LT組均明顯增加(P<0.05);高糖+LT組較高糖組、高糖+LT+TG組較高糖+TG組均明顯減少(P<0.05)。見表1、圖4。

圖4 Transwell實驗檢測各組細胞遷移數(結晶紫染色,×200)

2.6LT對各組細胞IRE1-TRAF2-ASK1-JNK相關蛋白表達水平的影響 各組細胞中IRE1、TRAF2、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK比較:高糖組較空白組、高糖+TG組較高糖組、高糖+LT+TG組較高糖+LT組均明顯增加(P<0.05);高糖+LT組較高糖組、高糖+LT+TG組較高糖+TG組均明顯減少(P<0.05)。見表1、圖5。

1～6:空白組、高糖組、高糖+LT組、高糖+TG組、高糖+LT+TG組

3 討 論

糖尿病性血管病尤其是動脈粥樣硬化是糖尿病患者殘疾、死亡的主要原因〔10〕。雖然糖尿病性血管病的發病機制仍不完全清楚,但大多危險因素集中在血管壁上,特別是VSMCs。VSMCs功能障礙可促進斑塊體積的增長,加速細胞外基質的沉積,最終導致內瘺血管壁增厚、狹窄〔11〕,故靶向VSMCs可能是治療糖尿病性血管病的新方向。

LT又稱為血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑,價格低廉,且適用于維持性血液透析患者。在2型糖尿病腎病研究中,LT可以促進患者血管內皮功能恢復,治療效果較佳,安全性較高〔12〕。隨著糖尿病、高血壓等此類代謝疾病發病率升高,心血管并發癥逐漸增多,而血管內膜增生機制參與血管介入治療后再狹窄、冠狀動脈搭橋術以及動脈粥樣硬化等心血管并發癥的病理過程〔13,14〕。因此血管內膜增生機制是血管外科醫生關注的問題。據報道血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑可有效減少冠狀動脈支架置入后繼發的內膜增生〔15〕。應用血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑可通過調控血管平滑肌前體樣細胞抑制動脈損傷患者內膜增生〔16〕。但是對于LT是否能通過抑制VSMCs增殖、遷移,促進其凋亡,改善VSMCs受損進而抑制血管內膜增生,達到治療糖尿病性血管病目的尚不可知。本研究結果推測,LT在一定程度上可以抑制VSMCs過度增殖和氧化應激損傷,可作為糖尿病性血管病治療的潛在藥物,但其具體機制尚缺乏研究。

內質網應激是一種基本的細胞反應,會產生非折疊蛋白反應。研究發現內質網應激可導致VSMCs增殖,促進血管內膜增生、血管重構,減輕內質網應激可以抑制血管內膜增生〔17〕。IRE1屬于內質網應激的效應蛋白,IRE1α是其中一種亞型,在各個細胞中廣泛存在,一旦受到刺激,IRE1α便會解離進而募集TRAF2,之后共同激活ASK1,形成三聚體,促使JNK的磷酸化,參與細胞生命活動〔18〕。Xue等〔19〕研究發現,激活素A可通過抑制IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路活化來保護PC12細胞免受內質網應激介導的凋亡和自噬性細胞死亡。Kim等〔20〕研究證明,LT可抑制內質網應激,抑制單側輸尿管梗阻誘導的腎纖維化,保護腎臟。本研究結果提示,IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路的活化可能與高糖誘導的VSMCs損傷有關。LT可能通過抑制IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路,降低內質網應激,抑制VSMCs受損。表明LT可抑制VSMCs增殖、遷移,促進細胞凋亡,與抑制IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路有關。

綜上,LT可能通過抑制IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路的激活,調節高糖誘導的VSMCs增殖、遷移和凋亡,可作為糖尿病性血管病治療的潛在藥物。