薯蕷皂苷對放射性腸黏膜炎癥損傷小鼠的保護作用

孔凡國 彭濤 刁興元 許昌芹

(1濟南市人民醫院消化內科,山東 濟南 271100;2山東省立醫院消化內科)

在2011年,癌癥是經濟發達國家的主要死因,也是發展中國家的第二大死因〔1〕。放療是各種惡性腫瘤和嚴重疾病的重要治療方式,尤其是鱗狀細胞癌〔2〕。技術創新使局部輻射幾乎可以傳遞到身體的任何部位〔3〕。但是,正常組織毒性仍然是臨床放射治療中最重要的劑量限制因素,且輻射對哺乳動物的生物學效應是劑量依賴性和累積性的〔4〕,這些不利的副作用,例如放射誘導的造血和胃腸道功能障礙甚至死亡,降低了患者的生活質量并限制了他們的放射治療〔5〕。薯蕷皂苷是一種類固醇皂甙,是六味地黃湯和地心血康等中成藥的有效成分〔6,7〕。《神農本草經》記載:“薯蕷香甜,平平,具有減少內臟損傷,增強供血不足的特點”,還可以祛邪除熱,補氣養血,促進肌肉生長。此外,薯蕷皂苷可以增加聽覺和視覺的敏感性,并延長預期壽命〔8〕。近年來的一些研究表明,薯蕷皂苷可以通過調節多個靶點和信號通路來保護肝臟,腎臟,大腦和胃腸道損傷,并調節包括糖尿病,骨質疏松,肥胖和高尿酸血癥在內的代謝疾病。此外,薯蕷皂苷對炎癥和細胞凋亡具有有效的作用〔9,10〕。然而,薯蕷皂苷在放射誘導的腸黏膜損傷中發揮何作用尚不清楚。本研究旨在探究薯蕷皂苷對放射性腸黏膜炎癥損傷的保護作用及機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物 雄性BALB/c小鼠(7～8周齡)獲自新鄉醫學院動物實驗中心。將小鼠飼養在特定的無病原體,溫度(23±1)℃,相對濕度(55±5)%,并進行12 h的明暗循環(從06∶00到18∶00點亮)的房間的籠子中,4只/籠。所有實驗遵照新鄉醫學院第一附屬醫院動物護理和使用委員會批準。

1.2輻射暴露和實驗方案 小鼠以1.2 Gy/min的吸收劑量率接受一次7.5 Gy的全身X射線照射(RS2000輻照器;Rad Source Technologies,Inc.,Suwanee,GA,美國),并不斷循環新鮮空氣避免在輻射室中產生缺氧狀況。將小鼠保存在帶孔的塑料瓶中以進行單獨照射。

小鼠隨機分為4組,每組10只,即正常對照(Con,不進行放射)組,X射線照射造模(RT)組,RT+150 mg/kg薯蕷皂苷和RT+300 mg/kg薯蕷皂苷組〔均進行腹部照射,且第0天均灌胃一次相應劑量薯蕷皂苷(Sigma Aldrich,USA,純度≥93%)。Con組及RT組以相同方式灌胃生理鹽水。通過直接心室穿刺獲得血液樣本,并在腹部照射后第3天收集小腸,實驗獨立進行了3次。并連續稱量小鼠照射后16 d的體質量和食物攝入量。

1.3組織病理學 輻射后72 h,收集腸道組織,將組織固定在0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)中的4%多聚甲醛中,包埋在石蠟中,切成4 μm厚的切片,進行蘇木素-伊紅(HE)染色。使用Chiu等〔11〕定義的組織學損傷量表,以盲法評估和分級黏膜損傷,炎癥和充血/出血。黏膜損傷根據以下標準從0～5分級:0級,正常黏膜絨毛;1級,絨毛頂端的上皮下出現格魯恩哈根間隙,常伴有毛細血管充血;2級,上皮下間隙的擴張,并從固有層適度抬升上皮層;3級,大量的上皮向下舉起絨毛的側面,可能有一些裸露的尖端;4級,裸露的絨毛,帶有固有層和擴張的毛細血管,可能是固有層的細胞增多;5級,固有層的消化和崩解,出血和潰瘍。各個變化的得分總和構成輻射損傷得分(RIS)。

1.4TUNEL分析 輻射后72 h,收集腸道組織,使用TUNEL測定法評估凋亡程度。使用凋亡檢測試劑盒(TdT-Fragel TM DNA片段檢測試劑盒,QIA33,Calbiochem,美國)檢測DNA片段化。下面列出的所有試劑來自試劑盒,并按照制造商的說明進行制備。將5 μm厚的腸段在二甲苯中脫蠟并通過梯度酒精進行水合;將它們與20 mg/ml蛋白酶K孵育20 min,并在TBST中沖洗;將切片與平衡緩沖液孵育10～30 min,用TBST沖洗;在37 ℃的濕潤環境中將切片與TdT酶孵育90 min;隨后在室溫下放入預熱的清洗緩沖液中10 min,并與封閉緩沖液一起孵育30 min。使用二氨基聯苯胺(DAB)標記,甲基綠進行反染,將切片脫水并固定計數TUNEL陽性細胞,以TUNEL陽性細胞/100個腸絨毛細胞比例作為凋亡指數,盲法在10個隨機選擇的區域中使用NIS Elements BR3.1(日本尼康)軟件分析TUNEL陽性信號。

1.5Western印跡 輻射72 h后,將小鼠處死,收集腸組織。從腸組織提取的蛋白質通過二喹啉甲酸(BCA)分析(Beyotime,中國)進行定量。蛋白經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后,將蛋白電轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,經封閉后,室溫分別孵育一抗抗Claudin-1(ab5694),抗ZO-1(ac5784)1.5 h,TBST洗膜3次后,室溫孵育1∶2 000稀釋的二抗〔辣根過氧化物酶(HRP)標記的免疫球蛋白(Ig)G,#7076,Cell Signaling Technology,美國〕45 min,TBST洗膜3次后,利用增強的電化學發光(ECL)試劑盒(#P0018AS,碧云天,上海)對目的條帶顯影,以β-actin(#AF0003,碧云天,上海)為內參,采用AlphaView軟件測量目的條帶的光密度。

1.6實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qPCR)分析 根據制造商的說明,使用TRIzol試劑(美國,Invitrogen)從腸組織中分離總RNA。使用M-MLV逆轉錄酶產物(Promega,美國)。使用ABI 7500實時PCR系統(美國Applied Biosystems)進行qPCR。引物序列如下:IL-1β:上游引物:5′-GCAACTGTTCCTGAACTCA-3′,下游:5′-CTCGGAG CCTGTAGTGCAG-3′,TNF-α:上游引物:5′-GCCTCTTCTCATTCCTGCTT-3′,下游:5′-CACTTGGTGGTTTGCTACGA-3′,GAPDH:上游引物:5′-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3′,下游:5′-GCTCCTGGAAGATGG-TGATGG-3′。qPCR變性條件下于94 ℃ 2 min,94 ℃ 15 s,62 ℃ 40 s 40個循環。使用2-ΔΔCt比較法確定每個靶基因的相對表達,并針對GAPDH進行歸一化。每個樣品重復3次,并在3個獨立的實驗中重復。

1.7抗氧化狀態的生化分析 將冷凍的腸組織勻漿。將勻漿物過濾并使用冷凍離心機在4 ℃下離心,將上清液等分裝在-20 ℃下冷凍,直至用于生化分析。使用Lowry等〔12〕的方法測定上清液中的蛋白質含量。根據Draper等〔13〕的方法,測定了丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平。

1.8統計學分析 采用GraphPad Prism6軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1薯蕷皂苷對放射性腸損傷臨床癥狀的影響 與Con組比較,RT組輻射誘發的體質量和食物攝入量在輻射后2～16 d均顯著下降(P<0.001);4～16 d與RT組比較,RT+150 mg/kg和300 mg/kg薯蕷皂苷組體質量和食物攝入量均顯著上升,以RT+300 mg/kg薯蕷皂苷組最為顯著(P<0.05)。見表1、表2。

表1 各組體質量變化比較

表2 各組食物攝入量變化比較

2.2薯蕷皂苷對放射性腸損傷的組織病理學和腸道細胞凋亡的影響 放射治療組表現為腸道絨毛縮短,絨毛上皮缺失,多處糜爛,炎性細胞浸潤,壞死和腸壁出血;然而經150和300 mg/kg薯蕷皂苷處理后,放射誘導的腸黏膜損傷明顯改善。與Con組比較,RT組腸黏膜組織學評分明顯增加,而薯蕷皂苷明顯降低了放射誘導的腸黏膜組織學評分(P<0.01)。除此之外,還采用TUNEL分析方法檢測了腸道細胞的凋亡程度,結果顯示,與Con組比較,RT組腸道細胞凋亡率明顯增加,而經150和300 mg/kg薯蕷皂苷處理后凋亡率明顯降低,以300 mg/kg薯蕷皂苷處理組最為顯著(P<0.01,P<0.001)。見圖1、表3。

圖1 薯蕷皂苷對放射性腸損傷的組織病理學和腸道細胞凋亡的影響(×40)

表3 薯蕷皂苷對放射性腸損傷的組織病理學和腸道細胞凋亡的影響

2.3薯蕷皂苷對放射誘導的腸組織中Claudin-1和ZO-1蛋白表達的影響 與Con組比較,RT組腸組織中Claudin-1和ZO-1蛋白表達均顯著降低(P<0.001),而經150和300 mg/kg薯蕷皂苷處理后,放射誘導的腸組織中Claudin-1和ZO-1蛋白表達均顯著升高(P<0.01,P<0.001),以300 mg/kg薯蕷皂苷處理組最為顯著。見圖2、表4。

1～4:Con組、RT組、RT+150 mg/kg薯蕷皂苷組、RT+300 mg/kg薯蕷皂苷組

表4 薯蕷皂苷對放射誘導的腸組織中Claudin-1和ZO-1蛋白表達、SOD、MDA水平和IL-1β、TNF-α mRNA水平的影響

2.4薯蕷皂苷對放射誘導的腸組織中SOD、MDA水平和IL-1β、TNF-α mRNA水平的影響 與Con組比較,RT組腸組織中SOD水平顯著降低;而經150 mg/kg和300 mg/kg薯蕷皂苷處理后,放射誘導的腸組織中SOD明顯升高,以RT+300 mg/kg薯蕷皂苷組最為顯著(P<0.01,P<0.001);MDA水平變化與SOD相反。RT組腸組織中IL-1β、TNF-α mRNA水平較Con組明顯升高,150 mg/kg和300 mg/kg薯蕷皂苷處理明顯逆轉了放射誘導的IL-1β、TNF-α mRNA水平升高(P<0.01,P<0.001)。見表4。

3 討 論

放射療法是治療骨盆腔或腹部癌癥患者的主要方法之一〔14,15〕。腸黏膜炎癥損傷是放射療法治療腹部癌的最常見副作用,小腸對放射誘發的損害的敏感性是放射療法處方劑量的限制因素。放射治療引起的腸炎并伴有各種臨床癥狀,降低了患者的生活質量,并增加了治療費用和社會醫療費用〔16,17〕。目前尚沒有廣泛使用的方法來減少輻射誘發的腸炎的發生或減輕其嚴重性。本研究發現,在放療時,給予薯蕷皂苷可顯著減輕放療引起的腸炎的臨床癥狀,包括食物攝入減少和體質量減輕。這些作用可以通過減少細胞死亡,氧化應激和炎癥來解釋。

輻射消除癌細胞的機制涉及體內自由基的產生和癌細胞DNA結構的破壞,從而導致細胞死亡〔18〕。但是,在臨床實踐中,這種現象不僅發生在癌細胞中,而且在受放射線影響的正常組織中也發生。預防正常組織中的DNA損傷和隨后的細胞死亡可以減少輻射的副作用。有研究〔16〕發現,射線照射會引起腸上皮屏障功能受損,因此在本研究中采用蛋白質免疫印跡方法分析了小腸中緊密連接分子Claudin-1和ZO-1蛋白水平,以評估了腸屏障功能,結果說明薯蕷皂苷能改善輻射誘導的腸上皮屏障受損。

輻射后發生的炎癥可通過一系列過程誘導,包括ROS,DNA損傷,脂質過氧化和凋亡。盡管炎癥對于解決體內各種類型的損傷是必需的,但是放射后發生的炎癥會引起各種臨床癥狀,持續的炎癥可能會導致嚴重的后果,例如癌癥。因此,盡早解決炎癥通常是有益的。

綜上,放療時薯蕷皂苷治療通過減少組織損傷,細胞死亡,氧化應激和炎癥降低了輻射誘發的腸黏膜炎癥損傷。因此,薯蕷皂苷對輻射引起的腸黏膜炎癥損傷具有輻射防護作用。