miR-576-5p通過結合CADM2調節胃腺癌DNA損傷和放化療敏感性

裴正浩 王耿澤 夏西超 張虎 王鈞 郝陽

(1南陽市中心醫院胃腸外科,河南 南陽 473000;2平頂山學院醫學院)

胃腺癌是起源于胃壁表層黏膜上皮細胞的消化道惡性腫瘤之一,多發生于胃竇、幽門、賁門等部位〔1〕。早期胃腺癌癥狀不顯,診斷率低,大多數患者往往在晚期才被診斷出來,錯過了最佳手術期,治療效果大打折扣〔2〕。目前臨床治療晚期胃腺癌多通過輔助放化療、分子靶向治療和免疫治療等方式,但因晚期胃腺癌患者多伴有遠處轉移和化療抵抗〔3〕,放化療的治療效果較差,因此尋找胃腺癌治療新的分子靶點意義重大。miRNAs是一類長度約為22個核苷酸的內源性小非編碼RNA,被過往研究證實可作為胃腺癌治療的有效靶點,參與調控胃腺癌的腫瘤進展〔4〕。miR-96-5p在胃腺癌患者血漿和胃腺癌細胞中過度表達,miR-96-5p通過靶向抑制叉形頭轉錄因子的O亞型FOXO3表達,顯著促進胃腺癌細胞的體外增殖〔5〕。miR-576-5p作為miRNAs家族的一員,尚不清楚其在胃腺癌細胞增殖、DNA損傷和耐藥機制中發揮的具體作用。調控細胞黏附分子(CADM)2是類膜表面糖蛋白,參與維持細胞黏附、極性和腫瘤抑制等過程,在膠質瘤等實體瘤中異常表達,并影響腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲等細胞生命周期〔6〕。有報道稱,CADM2可受miR-146a等miRNA調控,抑制腎透明細胞癌的細胞增殖、遷移和侵襲〔7〕。本實驗旨在探究miR-576-5p調控CADM對胃腺癌細胞DNA損傷和化療敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1生物信息學分析 GSE26595、GSE158662和GSE61741數據集下載自GEO數據庫,GEO2R軟件分析差異表達基因。下載TCGA_STAD數據矩陣,分析miR-576-5p在胃腺癌組織中的表達水平。基因富集分析miR-576-5p與細胞增殖和DNA損傷的關系。miRNA數據庫及靶基因分析軟件PITA和microT在線預測miR-576-5p的下游靶基因,FDR<0.25時視為基因顯著性富集。

1.2細胞培養和轉染 人胃腺癌細胞系BGC-823和SGC-7901細胞購自美國菌種保藏中心,酒精消毒超凈臺后,將含有10%胎牛血清的DMEM培養基放置在超凈臺,將BGC-823和SGC-7901放入培養基中,并加入含1%青霉素和鏈霉素混合物的抗體,將培養置于二氧化碳濃度為5%,溫度為37 ℃的恒溫箱中,每隔48 h更換一次培養液,待細胞生長密度接近100%前對其進行消化傳代,按照轉染說明書(上海羅氏制藥有限公司)將miR-576-5p質粒和對照miR-NC轉染至BGC-823和SGC-7901細胞中,用G418篩選出穩定過表達miR-NC/miR-576-5p的BGC-823和SGC-7901,用于后續實驗。按照轉染說明書,在BGC-823/SGC-7901 miR-576-5p細胞中轉染CADM2過表達質粒,仍然保持培養箱中二氧化碳濃度為5%,溫度為37 ℃,孵育48 h后做后續實驗。

1.3細胞計數試劑盒(CCK8)檢測細胞活力 取經不同細胞轉染后的對數生長期各組BGC-823和SGC-7901細胞,按照5×103個/孔接種于96孔板中,保持每孔中二氧化碳濃度為5%,溫度為37 ℃,培養24 h后加入10 μl的CCK8溶液,使用微孔板酶標儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)檢測各組細胞在波長450 nm處的吸光度值,分別于CCK8處理后的5 d內進行檢測。

1.4實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測細胞中mRNA表達 采用TRIzol試劑(Invitrogen公司)將BGC-823和SGC-7901細胞中的總RNA提取出來,逆轉錄成cDNA后,使用便攜式qRT-PCR儀(濟南泰醫生物技術有限公司)進行PCR檢測,測定BGC-823和SGC-7901細胞中miR-576-5p(以U6作為標準化內參)和CADM2(以GAPDH作為標準化內參)的mRNA表達。miR-576-5p上游引物5′-TTGGGTCAAGAGTCAGAAGTTT-3′,下游:5′-TGGCTTCTACTTGTCCTTTCC-3′;CADM2上游引物5′-ATTTGACCACTGGAGGGAGG-3′,下游:5′-TTCCTTCCCCAGCCCTTTAG-3′;U6上游引物5′-AAAGCAAATCATCGGACGACC-3′,下游:5′-GTACAACACATTGTTTCCTC GGA-3′;GAPDH上游引物5′-ATCATCCCTGCCTCT ACTGG-3′,下游:5′-GTCAGGTCCACCACTGACAC-3′。

1.5Western印跡檢測細胞中的蛋白表達 收集2×106個未經處理的BGC-823和SGC-7901細胞,用預冷的磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)洗滌細胞3次,將各組細胞裂解后以二喹啉甲酸(BCA)法測定上清液中的蛋白濃度。將各組細胞凝膠電泳后轉移至聚偏氟乙烯膜封閉2 h,緩沖液洗滌3次后,加入CADM2和磷酸化組蛋白H2AX(γH2AX)一抗于4 ℃條件下孵育16～18 h,緩沖液洗滌3次后,加入辣根過氧化物酶標記的二抗,室溫下孵育1 h,緩沖液沖洗后用超敏化學發光液顯影,ImageJ軟件分析CADM2和γH2AX蛋白灰度值。

1.6射線照射和免疫熒光 取對數生長期的BGC-823和SGC-7901細胞,更換新鮮培養基后,將細胞轉移至含賴氨酸的蓋玻片上,第2天按照國家次級標準劑量學實驗室γ射線照射標準對BGC-823和SGC-7901細胞進行照射,劑量分別為0、2、4、5 Gy。

1.7雙熒光素酶活性實驗 構建野生型及突變型CADM2報告基因,按照上述轉染步驟將miR-576-5p模擬物轉染至BGC-823和SGC-7901細胞中,48 h后按照雙熒光素酶試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)說明書操作,以測定各組細胞熒光素酶活性,驗證miR-576-5p和CADM2的調控關系。

1.8裸鼠成瘤實驗 將購買的18只無胸腺裸鼠飼養于裝備有空氣過濾裝置的飼養籠中,保持28 ℃的恒溫條件,維持相對濕度在40%左右,給予充足光照、飼料及潔凈的水源,定期對飼養籠進行滅菌處理。將穩定表達miR-576-5p的BGC-823細胞消化高速離心后,PBS重懸后調整細胞密度為1×107個/ml。采用容量為1 ml的注射器將BGC-823細胞懸液沿裸鼠皮下進針后前行至腋下,每只裸鼠分別注射100 μl細胞懸液,待觀察到皮下腫塊形成后表明裸鼠成瘤模型構建成功,分別在成瘤后0～14 d時采用游標卡尺測量腫瘤最長直徑和最短直徑,腫瘤體積=(最長直徑×最短直徑2)/2,成瘤2 w后處死裸鼠,分離腫瘤組織,并稱重。

1.9統計學分析 采用Graphpad Prism8軟件繪制圖表,SPSS22.0軟件進行χ2檢驗、單因素方差分析及受試者工作特征(ROC)曲線。

2 結 果

2.1miR-576-5p在胃腺癌的表達 GEO R分析GSE26595和GSE61741的差異表達基因,其中GSE26595有21個上調基因,GSE61741有94個。對上調表達基因取交集,發現在hsa-miR-432、hsa-miR-576-5p、hsa-miR-224、hsa-miR-1246等4個共同上調的差異miRNA中,miR-576-5p在胃腺癌中沒有被研究過。TCGA_STAD數據結果顯示,miR-576-5p在腫瘤組織表達(4.01±0.72)顯著高于癌旁組織(1.54±0.46;P<0.05)。ROC曲線表明,miR-576-5p對于胃腺癌的診斷有較高的臨床價值〔曲線下面積(AUC)0.742,敏感度70.75%,特異性71.74%,95%CI:0.699～0.782,P<0.05〕。以miR-576-5p表達水平的四分位數分組,將TCGA中胃腺癌患者分為低四分之一和高四分之三兩組,GSEA分析發現調控細胞增殖和DNA損傷相關基因集富集在miR-576-5p高表達組,表明miR-576-5p表達水平與細胞增殖和DNA損傷有關(FDR<0.25),見圖1。

圖1 miR-576-5p在胃腺癌中高表達,與胃腺癌DNA損傷和細胞增殖有關

2.2miR-576-5p在體內外促進胃腺癌細胞增殖 向胃腺癌BGC-823和SGC-7901細胞中轉染miR-576-5p模擬物,qRT-PCR結果表明,與miR-NC組(0.97±0.08、1.00±0.10)相比,miR-576-5p組miR-576-5p表達(5.08±0.56、5.32±0.05)顯著上調(P<0.05)。CCK8檢測細胞活力發現,與miR-NC組相比,miR-576-5p組細胞活力顯著增強(P<0.05),見表1。體內實驗結果表明,miR-576-5p過表達顯著誘導了胃腺癌BGC-823細胞的體內生長,腫瘤體積顯著增加(P<0.05),見表2。成瘤2 w后,miR-576-5p組腫瘤質量〔(0.31±0.05)g〕顯著大于miR-NC組〔(0.24±0.03)g;P<0.05〕。qRT-PCR檢測腫瘤組織中miR-576-5p的表達,結果發現miR-576-5p在miR-576-5p過表達的腫瘤組織中(4.22±0.41)較miR-NC組(1.01±0.09)顯著上調(P<0.05)。

表1 兩組BGC-823和SGC-7901細胞活力比較

表2 兩組不同時間點腫瘤體積變化

2.3miR-576-5p抑制胃腺癌細胞DNA損傷 免疫熒光法檢測γ射線照射的胃腺癌BGC-823和SGC-7901細胞中γH2AX焦點形成情況,結果發現隨著照射劑量的增加,γH2AX焦點數量顯著減少(P<0.05)。Western印跡結果表明,與miR-NC組相比,miR-576-5p組γH2AX蛋白表達顯著下調,且呈照射劑量依賴性,見圖2、圖3。

1～2:miR-NC組、miR-576-5p組

圖3 兩組不同劑量照射下γH2AX焦點數量(×4,雙向電泳凝膠染色法)

2.4miR-576-5p抑制胃腺癌細胞對多柔比星的化療敏感性 將不同濃度(0、0.001、0.010、0.100、1.000、10.000 μg/ml)的多柔比星處理胃腺癌BGC-823和SGC-7901細胞,CCK8檢測細胞活力,結果發現與miR-NC組相比,miR-576-5p劑量依賴性抑制細胞活力(P<0.05),見表3。

表3 兩組BGC-823和SGC-7901細胞對多柔比星的化療敏感性比較

2.5miR-576-5p能夠結合CADM2,且抑制其表達 PITA和microT在線預測MiR-576-5p的靶基因,并與GSE158662數據中胃腺癌表達下調的基因取交集(圖4),CADM2、TOX、PRKACB、AK4、LRRC17、ERO1B、LIFR 7個基因表達下調(LogFC分別為-1.03、-1.31、-1.66、-1.80、-2.06、-2.32、-2.68)。下載TCGA_STAD數據,進一步對這7個基因分析,發現CADM2與細胞增殖和DNA損傷均相關(CADM2中位數分組)(圖5)。miR-576-5p靶向并結合CADM2(圖6)。與miR-NC組相比,miR-576-5p組CADM-WT-3′UTR(0.52±0.04)顯著低于miR-NC組(1.01±0.09;P<0.05),CADM2-MT-3′UTR(1.00±0.11、1.01±1.00)無統計學差異(P>0.05)。與miR-NC組BGC-823、SGC-7901 mRN(1.01±0.08、1.00±0.09)相比,miR-576-5p過表達顯著抑制了CADM2 mRNA(0.32±0.05、0.34±0.03)和蛋白表達(P<0.05),見圖7。

圖4 PITA和microT在線預測MiR-576-5p的靶基因,并與GSE158662數據中胃腺癌表達下調的基因取交集

圖5 基因富集分析miR-576-5p與細胞增殖和DNA損傷的關系

圖6 miR-576-5p靶向并結合CADM2

1～3:miR-NC組、miR-576-5p組、miR-576-5p+CADM2組

2.6miR-576-5p通過靶向結合CADM2促進胃腺癌細胞增殖 miR-576-5p過表達的BGC-823和SGC-7901細胞中轉染CADM2過表達質粒,Western印跡檢測結果發現,與miR-NC組相比,miR-576-5p組CADM2表達顯著下調,而與miR-576-5p組相比,miR-576-5p+CADM2組CADM2表達上調,見圖7。CCK8檢測結果發現,與miR-NC組相比,miR-576-5p組細胞活性顯著增強,而與miR-576-5p組相比,miR-576-5p+CADM2組細胞活性顯著被抑制(P<0.05),見表4。

表4 3組BGC-823和SGC-7901細胞活性比較

3 討 論

胃腺癌是世界范圍內最常見、最致命的惡性腫瘤之一,現階段治療胃腺癌的重要手段為放射治療、化學治療、分子治療等,而腫瘤細胞的化療敏感性降低是導致化療失敗的最主要原因〔8〕。隨著對胃腺癌的不斷探究,越來越多的研究發現,DNA損傷是引發胃腺癌等癌癥的重要因素〔9,10〕。當DNA的雙螺旋分子結構被破壞,DNA雙鏈斷裂,缺少完整的互補鏈作為修復模板,導致基因組穩定性降低,最終引發癌癥〔11〕。然而對于腫瘤細胞而言,腫瘤細胞的DNA損傷可使其細胞損傷修復能力顯著增強,進而影響腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性。本實驗發現,胃腺癌的DNA損傷和化療敏感性的改變與細胞內miR-576-5p的異常表達有關,miR-576-5p通過靶向結合CADM2,抑制胃腺癌細胞DNA損傷,增強化療抵抗性,促進細胞增殖,加速胃腺癌的惡性進展。

多種miRNA表達失調被證實與胃腺癌等惡性腫瘤增殖、遷移、侵襲、凋亡、上皮間細胞-充質轉化和耐藥有關〔12,13〕,Zheng等〔14〕研究發現,M2極化的腫瘤相關巨噬細胞miR-21外泌體可從巨噬細胞轉移至胃腺癌細胞中,通過抑制PTEN基因表達,激活PI3K/AKT通路的磷酸化,抑制細胞凋亡,顯著促進胃腺癌細胞對順鉑的耐藥性。此外,也有報道顯示,miR-21、miR-24和miR-421等miRNA在彌漫性胃腺癌組織中高表達,并成為DNA損傷應答的靶基因,通過調控APE1等活性氧誘導損傷修復基因及ATM、ATR和H2AX等DNA損傷識別基因的表達,影響胃腺癌的DNA損傷過程〔15〕。本研究結果與之較為相符,發現miR-576-5p在胃腺癌中高表達,過表達miR-576-5p可通過抑制DNA損傷,抑制胃腺癌細胞對化療藥物多柔比星的敏感性,促進胃腺癌細胞增殖。這可能與miR-576-5p對DNA損傷標志蛋白γH2AX基因的調控作用有關,miR-576-5p通過下調γH2AX的表達,通過直接修復、堿基切割修復和核苷酸剪切修復等多種途徑保護腫瘤細胞免受化療藥物的DNA損傷效果〔16〕,抑制其化療敏感性,誘導腫瘤進展。CADM2最初被認為是與肥胖和抑郁、焦慮、雙相情感障礙等精神疾病有關的基因〔17〕,最新研究發現,CADM2可作為多種miRNA的下游靶點,與miRNA分子及多種蛋白和信號通路結合,參與影響多種惡性腫瘤的發生發展,在腫瘤中發揮維持細胞極性和抑癌的作用〔18〕。如miR-10b與CADM2的3′非翻譯區結合,過表達miR-10b下調CADM2的表達,上調肝細胞Hep 3B細胞中FAK的表達,激活AKT信號通路,進而誘導肝癌細胞遷移和上皮細胞-間充質轉化〔19〕。本研究也發現,CADM2是miR-576-5p的重要下游靶點,過表達miR-576-5p通過靶向抑制CADM2表達,抑制胃腺癌細胞DNA損傷,提高胃腺癌細胞對化療藥物的抵抗性,促進胃腺癌細胞體內外增殖。推測原因可能為,miR-576-5p作為CADM2的上游分子,通過促進CADM2啟動子的甲基化,進而下調胃腺癌細胞內CADM2表達,而CADM2作為抑癌基因,通過破壞腫瘤細胞內分子結構的完整和穩定性〔20〕,在胃腺癌細胞DNA損傷修復中發揮顯著的抑制作用,而miR-576-5p通過抑制其表達,進一步抑制了DNA損傷和對化療藥物的敏感性。本研究結果中,CADM2過表達逆轉了miR-576-5p對胃腺癌細胞的促增殖效應也進一步證實了這點。

綜上,miR-576-5p通過結合CADM2調節胃腺癌細胞DNA損傷和化療敏感性,其機制是通過靶向抑制CADM2,抑制γH2AX蛋白表達來實現,最終發揮其顯著的促癌效應,提示miR-576-5p/CADM2調節軸在胃腺癌細胞的DNA損傷和耐藥中發揮重要作用。