健脾益氣方干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1α-XBP1通路誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞自噬防治PF的機制

劉前程 劉鑫 鄧湘雨 周成涵 鐘文露 史偉,3 孟立鋒,3

(1廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧 530023;2廣西中醫(yī)藥防治醫(yī)學(xué)分子生物重點實驗室;3廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科)

腹膜纖維化(PF)是腹膜透析(PD)患者最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。腹膜間皮細(xì)胞(PMC)發(fā)生的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是PD過程中PF的早期事件,也是導(dǎo)致腹膜功能減退最終導(dǎo)致超濾衰竭的關(guān)鍵過程〔1〕。中藥健脾益氣方防治PD相關(guān)性PF在實驗及臨床研究中均已初步證實療效〔2～4〕。機制研究方面,健脾益氣方能夠拮抗轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β/Smad信號通路、自噬及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)損傷〔5,6〕,已有研究表明健脾益氣方能夠抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1α-XBP1通路〔5〕,然而,在體內(nèi)外實驗上尚缺乏ERS誘導(dǎo)自噬在PF疾病進(jìn)展中的研究。本文擬探討健脾益氣方干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1α-XBP1通路誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞自噬防治PF的機制。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級雄性SD大鼠72只,體質(zhì)量150～180 g,由湖南斯萊克景達(dá)動物實驗有限公司提供:SYXK(桂)2019-0001。動物實驗倫理審批號:DW20210426-080。飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實驗中心,自由進(jìn)食飲水。

1.2試劑 4.25% PD液(PDS,廣州百特醫(yī)療,批號:6AB9896);熱休克蛋白家族成員葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP)78、pIRE1α、XBP1s、微管相關(guān)蛋白1輕鏈(LC)3-Ⅱ、自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、E-鈣黏蛋白(cadherin)、α-肌動蛋白(SMA)測定試劑盒(英國Abcam公司)。

1.3藥物 健脾益氣方顆粒:黃芪30 g、黨參15 g、白術(shù)10 g、茯苓15 g、丹參15 g、大腹皮6 g、川芎7 g、葛根15 g、炙甘草8 g,由江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn),廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。按大鼠體表面積計算方法得出36、18、9 g/(kg·d)作為中藥高、中、低組。?；切苋パ跄懰崞?格利普生物科技有限公司,規(guī)格:200 mg),大鼠劑量為1.8 mg/(kg·d)。

1.4分組與給藥 72只大鼠,隨機數(shù)字法分為假手術(shù)組、模型組、西藥組、中藥高、中、低劑量組,每組12只。模型組與假手術(shù)組予生理鹽水2 ml,晨間灌胃,1次/d,連續(xù)4 w。

1.5PF模型的制備 假手術(shù)組不切除腎臟,只剝離腎臟包膜。模型組、西藥組、中藥高、中、低劑量組采取5/6腎切除聯(lián)合腹腔注射4.25%PD液(PDS)的方法構(gòu)建PF大鼠模型,具體方法參照文獻(xiàn)〔2〕。

1.6取材 第28天灌胃后處死大鼠,取壁層腹膜組織。修剪成約5 mm×5 mm大小。一半浸入多聚甲醛液(PLP)液中,4 ℃冰箱固定8 h,常規(guī)石蠟包埋。另一半,置-70 ℃冰箱保存待測。

1.7大鼠一般情況 檢測精神狀況、飲食、活動及體質(zhì)量等。

1.8蘇木素-伊紅(HE)染色觀察腹膜組織形態(tài)學(xué)改變 取大鼠腹膜組織,常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋、切片后,行HE、鈾-鉛雙染色,光鏡下觀察腹膜形態(tài)學(xué)變化。

1.9RT-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法測定IRE1α-XBP1通路自噬及纖維化標(biāo)志表達(dá)變化 Trizol一步法提取總RNA;紫外分光光度計測A值,波長260/280 nm比值介于1.8～2.0。DNA的合成參照Invitrogen反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作程序進(jìn)行。引物設(shè)計采用olige6和Primer5.0軟件聯(lián)合設(shè)計,引物序列(5′-3′):GRP78上游:CGTCGTATGTGGCCTTCACT,下游:ATTCCAAGTGCGTCCGATGA;XBP1s上游:CCGCAGCACTCAGACTACG,下游:GCAACAGCGTCAGA ATCCAT;E-cadherin上游:AGCTCGCTGAACTCCTCTGA,下游:TCGCCGCCACCATACATATC;a-SMA上游:AGAACACGGCATCATCACCA,下游:TCCGTTAGCAAGGTCGGATG;LC3-Ⅱ上游:GCCTTCTCTAAAAGGGCTTCTACT,下游:TGGAGACCTCTGCTAGGCAA;Beclin-1上游:GCCTCTGAAACTGGACACG A,下游:GCCTGGGCTGTGGTAAGTAA;βactin上游:CGTAAAGACCTCTATGCCAACA,下游:TAGGAGCCAGGGCAGTAATC。

1.10Western印跡測定GRP78、XBP1s、LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA及E-cadherin表達(dá)變化 400 μl裂解液提取腹膜組織總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法測量蛋白濃度后,進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)垂直電泳,轉(zhuǎn)膜。脫脂奶粉封閉后,分別加入抗體,孵育過夜。Tris鹽酸緩沖液吐溫(TBST)洗滌后,室溫下孵育二抗30 min,電化學(xué)發(fā)光(ECL)液顯色。

1.11免疫組化檢測GRP78、XBP1s、LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA及E-cadherin表達(dá)變化 采用SP法,一抗(GRP78、XBP1s、LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA、E-cadherin) 稀釋到合適濃度(1∶200),嚴(yán)格按照免疫組化步驟進(jìn)行操作。應(yīng)用LeicaQwin550圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析,每組隨機選取8張切片,400倍視野下測定陽性面積比。

1.12統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件處理。數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且總體方差齊,兩組間均數(shù)比較用t檢驗,多組間均數(shù)比較用單因素方差分析;數(shù)據(jù)不呈正態(tài)分布用秩和檢驗,用中位數(shù)和四分位數(shù)間距來進(jìn)行統(tǒng)計描述。

2 結(jié) 果

2.1各組一般情況 實驗期間,先后有14只實驗大鼠死亡,死亡原因包括麻醉過量、灌胃不當(dāng)?shù)?。最終大鼠數(shù)量為:假手術(shù)組11只,模型組、西藥組、中藥低劑量組各10只,中藥高劑量組9只,中藥中劑量組8只。各組試驗期間具有明顯差異,假手術(shù)組飲食良好,體質(zhì)量正常增加,且毛發(fā)光澤、反應(yīng)靈敏、活動自如;模型組進(jìn)食減少,體質(zhì)量增長緩慢,毛發(fā)稀疏、反應(yīng)遲緩、活動減少;與模型組相比,經(jīng)干預(yù)后,西藥、中藥高、中、低劑量組以上情況均有一定程度改善。

2.2光鏡下各組腹膜病理 如圖1所示,假手術(shù)組腹膜組織表面為一層扁平連續(xù)的PMC;模型、西藥、中藥高、中、低劑量組腹膜組織PMC均有不同程度的脫落,間皮下基質(zhì)有不同程度的增生及形態(tài)學(xué)上的改變,PMC呈現(xiàn)為圓形或柱形,以模型組表現(xiàn)最為明顯,提示本次實驗PF模型構(gòu)建成功。其次,與模型組比較,西藥、中藥高、中、低劑量組上述癥狀有所改善,其中中藥高劑量組改善情況最明顯。

圖1 各組腹膜組織(HE染色,×400)

2.3免疫組化測定結(jié)果 如表1所示,與假手術(shù)組比較,模型組GRP78、pIRE1α、XBP1s、LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA水平明顯上調(diào),E-cadherin水平明顯下調(diào)(P<0.05),表明高糖PDS誘導(dǎo)了大鼠PF,并且激活了PMC ERS及自噬。與模型組比較,西藥及中藥各劑量組GRP78、pIRE1α、XBP1s、LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA表達(dá)明顯下調(diào),E-cadherin表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05),表明健脾益氣方能夠抑制ERS及自噬水平,改善纖維化,且程度與藥物濃度相關(guān)。

表1 各組腹膜組織GRP78、XBP1s、LC3-Ⅱ、Beclin-1、E-cadherin、α-SMA蛋白陽性面積比較

2.4各組RT-PCR法及Western印跡法測定結(jié)果 與假手術(shù)組比較,模型組GRP78、XBP1s、LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA蛋白和mRNA及pIRE1α蛋白水平顯著上調(diào),E-cadherin蛋白和mRNA明顯下調(diào)(P<0.05),表明PD大鼠ERS及自噬激活,PF發(fā)生。與模型組比較,西藥組及中藥高、中、低劑量組GRP78、XBP1s、LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA蛋白和mRNA水平及pIRE1α蛋白水平顯著下調(diào),E-cadherin蛋白和mRNA水平明顯上調(diào)(P<0.05);表明健脾益氣方能夠抑制ERS、自噬的激活,改善PF。見表2、表3、圖2。

表2 各組腹膜組織 GRP78、XBP1s、pIRE1α、LC3-Ⅱ、Beclin-1、E-cadherin、α-SMA 蛋白表達(dá)量比較

表3 各組腹膜組織GRP78、XBP1s、LC3-Ⅱ、Beclin-1、E-cadherin、α-SMA mRNA表達(dá)量比較

1～6:假手術(shù)組、模型組、西藥組、中藥高、中、低劑量組

3 討 論

PF并沒有中醫(yī)專屬病名,現(xiàn)代醫(yī)家針對其病機及臨床表現(xiàn),將其歸屬于“水腫、虛勞、關(guān)格”等范疇論治,但并不能概括PD相關(guān)性PF疾病全貌。在病機認(rèn)識上,姜晨等〔7〕認(rèn)為,PD患者以氣血、陰陽虧虛為其病機關(guān)鍵,而瘀血、頑痰阻絡(luò)是疾病進(jìn)一步加重的重要因素。曹曼等〔8〕認(rèn)為,脾虛挾濕濁、血瘀是導(dǎo)致PD患者PF的關(guān)鍵病機。楊波等〔9〕認(rèn)為腎衰竭患者行PD治療后病機關(guān)鍵沒有改變,所以,PD相關(guān)超濾衰竭的主要病機仍為脾腎虧虛、濕濁瘀血內(nèi)蘊。課題組認(rèn)為,開始PD后,邪有出路,標(biāo)實減輕,虛證成為PD患者病機關(guān)鍵,并且腎臟功能被腹膜透析所替代,從而提出以微觀辯證為依據(jù)的“脾氣虧虛”基本病機〔10〕,組方健脾益氣方具有“健脾益氣、理氣活血和絡(luò)”的功效,契合PF的中醫(yī)病機,臨床療效顯著〔2,11〕。本研究結(jié)果表明,健脾益氣方對PD大鼠腹膜具有保護(hù)作用。

已知病理生理損傷會導(dǎo)致未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累并引起ERS,并通過未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài),促進(jìn)細(xì)胞存活。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)既可以接收信號,GRP78被視為ERS發(fā)生和UPR激活的標(biāo)志〔12,13〕。既往一些研究集中在ERS在纖維增生性疾病中的作用。如在四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中,ERS促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生〔14〕;抑制肺、心臟ERS能夠減輕結(jié)晶二氧化硅誘導(dǎo)的肺纖維化、改善大鼠心肌壞死的情況〔15,16〕。研究表明,PD可使腹膜間皮細(xì)胞產(chǎn)生ERS,ERS可以通過IRE1α-XBP1通路直接誘導(dǎo)激活自噬,重建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)〔17,18〕。在高糖刺激的人PMC中,XBP1s表達(dá)增加,并且與PMC的EMT這一現(xiàn)象呈顯著正相關(guān),表明XBP1s是PD相關(guān)性PF重要的分子之一〔19〕。本研究與既往研究一致。前期研究曾發(fā)現(xiàn)健脾益氣方抑制IRE1α、XBP1、白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α表達(dá),從而減輕腹膜間皮細(xì)胞EMT〔5〕。提示健脾益氣方可能通過抑制IRE1α-XBP1通路,對PD大鼠腹膜起到保護(hù)作用。

多種細(xì)胞程序進(jìn)程都有自噬的參與,在某些情況下,自噬促進(jìn)細(xì)胞的存活,異常的自噬(自噬過多或受損)會導(dǎo)致細(xì)胞死亡〔20,21〕。盡管有報道指出高糖會誘導(dǎo)激活自噬,但導(dǎo)致自噬激活的上游信號傳導(dǎo)仍不清楚〔22,23〕。研究表明,ERS是自噬的有效觸發(fā)因素〔24,25〕,但是在自噬水平增高對ERS狀態(tài)下PMC的命運有何影響,目前尚存在爭議。例如,在腎小管纖維化中,ERS可能通過PERK-eIF2α途徑誘導(dǎo)自噬的激活,促進(jìn)纖維化和細(xì)胞凋亡〔26〕;在胰腺纖維化中,Ren等〔27〕亦證實,ERS導(dǎo)致自噬的激活,通過抑制ERS誘導(dǎo)的分子伴侶介導(dǎo)的自噬可以減輕胰腺纖維化。與以上ERS狀態(tài)下自噬水平增高促進(jìn)纖維化、細(xì)胞凋亡的結(jié)論相反的是,部分學(xué)者認(rèn)為自噬是細(xì)胞對抗損傷的一種重要的代償保護(hù)機制。例如,在腎臟上皮細(xì)胞中,ERS通過誘導(dǎo)激活自噬減輕足細(xì)胞的損傷,起到防止細(xì)胞死亡的保護(hù)作用〔28,29〕;在神經(jīng)元細(xì)胞中,Zhou等〔30〕發(fā)現(xiàn),七氟烷可誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞ERS并激活自噬,從而拮抗了細(xì)胞凋亡。然而,在體內(nèi)、體外實驗上尚缺乏ERS誘導(dǎo)自噬在PF疾病進(jìn)展中的研究。本文前期研究〔31〕發(fā)現(xiàn),高糖PDS誘導(dǎo)PD大鼠PMC自噬激活,促進(jìn)α-SMA并下調(diào)E-cadherin表達(dá)。

PMC的EMT是PF的起始環(huán)節(jié)和可逆階段,在PF的發(fā)病進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用。本研究提示健脾益氣方能拮抗PD大鼠EMT的進(jìn)展。IRE1α-XBP1信號通路是一個重要的調(diào)節(jié)樞紐,它把ERS、自噬和EMT聯(lián)系了起來。本研究結(jié)果表明健脾益氣方能夠通過干預(yù)ERS通路IRE1α-XBP1誘導(dǎo)PMC自噬,激活其適應(yīng)性保護(hù)作用,逆轉(zhuǎn)高糖PDS刺激下的PMC損傷,達(dá)到減輕腹膜間皮細(xì)胞EMT,保護(hù)PMC存活、改善腹膜功能,拮抗PF作用,為PD誘導(dǎo)PF的發(fā)病機制研究及中醫(yī)藥治療提供新的思路和方法,其臨床應(yīng)用療效仍需要研究。